[发明专利]一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法

说明书

本发明公开了一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法。该方法即在质粒pACYC‑gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC‑gabTD（agtABCD）；减弱大肠杆菌上降解α‑酮戊二酸的关键酶系α‑酮戊二酸脱氢酶系的功能；重组菌株E.coliBL‑22AB和E.coli‑YDT（agtABCD）‑28LGOX1培养收菌后分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后加入催化体系中，加入0.5%TritonX‑100作为表面活性剂，再加入L‑赖氨酸和L‑谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。本发明方法使得生产成本得到进一步降低，是一种产率高、利用谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法。

技术领域

本发明涉及戊二酸制备技术领域，具体涉及一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法。

背景技术

戊二酸，别名：胶酸，α，γ一丙烷二竣酸，1，3一丙二竣酸，分子式为C₅H₈O₄，是一种重要的有机化工原料和中间体，在化学、建筑、医药、农业等方面具有广泛的应用。在塑料工业中，戊二酸及其戊二酸烷基酯类主要作为增塑剂的中间体，是聚氯乙烯、聚酯、聚酰胺以及聚氯乙烯的聚酯增塑剂的组成成分。在医药方面，戊二酸主要用于合成戊二酸酐，而戊二酸酐又可以作为很多药物的中间体，可用于合成新一代降血脂类药匹伐他汀和瑞舒伐他汀钙片。由于其良好的广谱杀菌能力，可以用来合成各种杀菌消毒洗液和医用药品等等。戊二酸也可合成液态聚酯，用于改良PET纤维的分子结构，从而改进PET纤维的染色性，提高上染率。利用戊二酸配制粘合剂可广泛粘接纺织品、金属等。此外，戊二酸或其酯也可用于聚酯多醇的合成、去垢剂的配制、含硫等烟道气的洗涤。

合成戊二酸的传统方法有回收法，化学合成法。回收法生产戊二酸主要依赖从己二酸的副产物中分离提纯，此法操作繁琐流程长，回收率低且不稳定。合成法主要有环戊酮液相氧化法、γ- 丁内酯法、二氢吡喃法和戊二腈法。合成法大多原料昂贵不易得，试剂毒性大污染环境，产品收率低，合成路线复杂等缺点。

Si Jae Park等人采用过表达了davAB和GabDT的重组E .coli WL3110菌株，在含有赖氨酸，葡萄糖和α-酮戊二酸的培养基里共同发酵生产了1 .7g/L戊二酸。此法发酵周期长且转化率低，且需要添加昂贵的α-酮戊二酸作为氨基受体，大大增加了生产成本。

Jia-Le Yu等人采用过表达了hgdH ,、gctAB、hgdABC、ter和tesB的重组E .coli菌株，以α-酮戊二酸为底物厌氧培养得到了3 .8mg/L戊二酸。此法反应体系复杂，原料昂贵且有副产物生成，戊二酸摩尔收率低。

目前为止，通过过表达谷氨酸转运基因、减弱α-酮戊二酸脱氢酶系以及加入表面活性剂的双细胞耦合后谷氨酸循环催化生产戊二酸的方法尚未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，该方法催化效果好，且中间产物少。

一种在大肠杆菌中提高合成戊二酸产量的生物催化方法，包括以下步骤：

步骤1，在实验室现有质粒pACYC-gabTD上过表达agtABCD 谷氨酸转运基因得pACYC-gabTD（agtABCD），所述agtABCD 谷氨酸转运基因来源于Pseudomonas aeruginosa ；

步骤2，减弱大肠杆菌上降解α-酮戊二酸的关键酶系α-酮戊二酸脱氢酶系的功能；

步骤3，培养重组菌株E .coliBL-22AB和E .coli-YDT（agtABCD）-28LGOX1，分别用pH7.0的PBS重悬并浓缩后，加入表面活性剂质量分数为0.5%TritonX-100，最后加入L-赖氨酸和L-谷氨酸钠催化反应生成戊二酸。