[发明专利]热稳定性提高的酮糖3-差向异构酶

说明书

本发明人发现了：在源自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的酮糖3‑差向异构酶的氨基酸序列中，通过取代特定的氨基酸，可得到热稳定性提高的突变酶，且发现了可有效地生产D‑阿洛酮糖。

技术领域

本发明涉及热稳定性提高的新型酮糖3-差向异构酶及其制备方法。

背景技术

D-阿洛酮糖(D-プシコース，D-psicose)作为自然界中仅微量存在的稀有糖的一种而已知，其甜度为砂糖的约70%，因此被用作甜味剂。还已知D-阿洛酮糖的热量值几乎接近于零，具有抑制血糖值升高等各种生理功能，作为具有功能性的食品原材料而受到关注。由于这样的情况，在食品工业中，对D-阿洛酮糖的有效且安全的生产方法的需求日益增加。

另一方面，由于D-阿洛酮糖是D-果糖的差向异构体，因此建立了使D-阿洛酮糖3-差向异构酶与D-果糖发生作用的生产方法。例如，公开了源自球形节杆菌(Arthrobacter globiformis) M30的酮糖3-差向异构酶(专利文献1)或源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(专利文献2)。另外，为了维持生产效率而抑制由温度引起的酶变性，使得热稳定性提高的源自根癌农杆菌的阿洛酮糖(サイコース/プシコース)差向异构体化酶突变体(专利文献3)或源自伯克霍尔德菌(Burkholderia)的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体(专利文献4)被用于D-阿洛酮糖的生产。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开2014/109254号公报；

专利文献2：日本特表2008-541753号公报；

专利文献3：日本特表2016-518135号公报；

专利文献4：CNA106350498号公报。

发明内容

发明所要解决的课题

如上所述，关于通过使D-阿洛酮糖3-差向异构酶等酶发生作用而进行的D-阿洛酮糖的生产方法提出了各种各样的办法，但作为源自像球形节杆菌这样的食品安全性已被认可的菌种的D-阿洛酮糖的生产酶、且热稳定性提高的酶的制造方法尚未确立。另外，虽然源自球形节杆菌的酮糖3-差向异构酶的最佳温度在镁(Mg²⁺)存在的条件下为60～80℃，但若在反应温度超过50℃的状态下长时间进行反应，则酶活性慢慢降低，存在着D-阿洛酮糖的生产减少的课题。

用于解决课题的手段

本发明人在对使酶发生作用来生产D-阿洛酮糖的方法进行各种研究时发现了：在源自球形节杆菌的酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列中，通过取代特定的氨基酸，可得到热稳定性提高的突变酶，且发现了可有效地生产D-阿洛酮糖。更具体而言，发现了可得到酮糖3-差向异构酶突变体，该突变体在SEQ ID NO: 1所表示的源自球形节杆菌的野生型酮糖3-差向异构酶的氨基酸序列内具有至少1个氨基酸突变，且(1) 70℃下的酶活性(T70)与50℃下的酶活性(T50)之比T70/T50显示出较野生型酮糖3-差向异构酶的T70/T50高的值；或者(2)在以未处理的酶在50℃下的活性为100的情况下，在50mM磷酸缓冲液(pH8.0、包含2mM的硫酸镁)悬浮液中，60℃下进行了1小时处理的相同的酶在50℃下的残留酶活性A显示出较野生型酮糖3-差向异构酶的A高的值。

即，本发明是根据上述见解而完成的，由以下的(1)～(9)构成。