[发明专利]一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株

说明书

本发明涉及一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D‑泛酸中的应用。本发明通过(1)加强lpd基因的表达(2)敲除glk、galP破坏葡萄糖非PTS转运系统，加强ptsG基因的表达而加强葡萄糖PTS转运系统(3)敲除yfbQ、ppsA基因(4)敲除poxB、pflB、ldhA基因(4)敲除ilvE基因(5)在质粒上引入异源的乙酰乳酸合酶基因alsS(6)在质粒上引入异源的泛酸转运体panT，最终得到最优的D‑泛酸高产大肠杆菌基因工程菌株。D‑泛酸效价从2.76g/L提高到6.33g/L。

(一)技术领域

本发明涉及一种提高基因工程菌泛酸产量的构建方法及菌株，以及该基因工程菌在微生物发酵制备D-泛酸中的应用。

(二)背景技术

泛酸，也称作维生素B5，是生物体内广泛存在的一种酸性物质，是辅酶A生物合成的重要前提物质，对生物体的生长起到显著的促进作用，但目前发现泛酸只能由植物和微生物合成。泛酸可广泛应用于食品、饲料、化妆品以及制药行业，具有良好的市场价值。有报道表明可以在甲醇或者乙醇环境中通过加热混合物D-泛解酸和β-丙氨酸从而获得饲料级D-泛酸，并且已投入工业化生产。光学纯的D-泛解酸内脂可以由化学拆分DL-泛解酸内脂获得，但是由于化学拆分试剂昂贵、条件苛刻，因此工业上普遍采用酶解法获得高纯度的D-泛解酸内脂。工业上以异丁醛和甲醛为原料，在酸性条件下经醛缩合、氰化氢加成和皂化反应合成DL-泛解酸内脂，再利用来自Fusarium moniliforme CGMCC的D-lactonohydrolase酶解获得D-泛解酸内脂。而另一底物β-丙氨酸目前也是由化学法合成，即利用丙烯酸、丙烯腈、β-氨基丙腈等腈类物质通过高温，高压，加入强酸、强碱的方法合成，或丙烯腈氨水解法。

现有的D-泛酸生产方法是化学合成法与酶法相结合，异丁醛与甲醛在碱性、高温条件下羟醛缩合形成羟基特戊醛，再添加氢氰酸，在酸性条件下进行醇氰化反应形成氰醇；氰醇在酸性条件下通过水解环化得到DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸内酯经L-泛解酸内酯水解酶水解，留下D-泛解酸内酯，产生的L-泛解酸再经化学内酯、外消旋转为DL-泛解酸内酯。得到的D-泛解酸内酯与β-氨基丙酸钙缩合直接制得D-泛酸钙。综合考虑D-泛酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产D-泛酸受到越来越多的关注。

大肠杆菌W3110中泛酸的合成途径可分为泛解酸和β-丙氨酸两个模块，我们把这两个模块途径看成是整个D-PA代谢途径中的“并联路线”。首先胞外葡萄糖经糖运输系统进入胞内(PTS系统和非PTS系统)，后经糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸(以下简称PEP)，在泛解酸模块中，PEP在丙酮酸激酶(由pykAF编码表达)的作用下反应生成丙酮酸(以下简称PYR)，PYR在乙酰乳酸合酶(由ilvGMIHBN编码表达)的作用下反应生成乙酰乳酸，再经两步反应生成α-酮异戊酸(以下简称2-KIV)，2-KIV在α-酮异戊酸羟甲基转移酶(由panB编码表达)、2-脱氢泛解酸还原酶(由panE、ilvC编码表达)的作用下生成泛解酸。在β-丙氨酸模块中，PEP在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(由ppc编码表达)作用下与HCO3-反应产生草酰乙酸(以下简称OAA)，OAA在天冬氨酸转氨酶(由aspC编码表达)作用下发生转氨反应生成天冬氨酸(以下简称ASP)，ASP在天冬氨酸脱羧酶(由panD编码表达)作用下发生脱羧反应生成β-丙氨酸。最后，泛解酸和β-丙氨酸在泛酸合成酶(由panC编码表达)的作用下消耗一分子ATP反应生成一分子D-泛酸。

除了主要合成途径(磷酸烯醇式丙酮酸到β-丙氨酸，丙酮酸到泛解酸)之外，D-泛酸的生物合成还跟NADPH和亚甲基四氢叶酸的供给相关，同时支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)的合成支路对D-泛酸的生物合成有着强烈的竞争作用，随着生物发酵技术理念的发展，以及近年来化学法生产受限于环保和成本问题，D-泛酸的发酵法生产也越来越具有可行性。