[发明专利]一种提高甲硫氨酸产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高甲硫氨酸产量的方法，所述方法为：将胱硫醚‑γ‑合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸。本发明方法通过增加甲硫氨酸合成过程中甲基的供应和高半胱氨酸的含量，其中工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt‑E1‑CGS‑MMT‑HMT发酵产生甲硫氨酸的产量是0.3g/L，相对于野生型E.coli BL21(DE3)菌株，甲硫氨酸的产量增加了9倍，显著提高了反应效率。

(一)技术领域

本发明涉及一种来自植物甲硫氨酸合成途径的多酶组合在微生物中发酵合成甲硫氨酸的应用方法，属于基因工程和生物发酵领域。

(二)背景技术

甲硫氨酸(Methionine，Met)是人类的必需氨基酸，必须从食物中获得。在生物体内甲硫氨酸在蛋白翻译起始、调节代谢、重要化合物前体等方面具有重要的生理生化功能。植物和微生物都可以通过从头合成途径-天冬氨酸合成途径合成甲硫氨酸，此外植物还可以通过一条补充途径S-甲基甲硫氨酸循环(SMM循环)在植物种子的发育过程中通过甲基循环大量提供甲硫氨酸。植物中胱硫醚-γ-合酶(CGS)催化O-乙酰-L-高丝氨酸与半胱氨酸合成胱硫醚，进而合成高半胱氨酸，是甲硫氨酸合成的限速酶，受到产物Met和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的反馈抑制。高半胱氨酸甲基转移酶(HMT)和甲硫氨酸甲基转移酶(MMT)是SMM循环中的两个关键酶。HMT将高半胱氨酸在SMM或SAM作为甲基供体时转化成2分子的甲硫氨酸；MMT是将甲硫氨酸与高半胱氨酸共同合成SMM，从而实现SMM循环。SMM循环可以在短期内实现植物种子发育所需Met的大量提供。

甲硫氨酸合成途径已经被解析，但生物体内甲硫氨酸的合成普遍较低，因而工业上甲硫氨酸基本通过化学法合成。化学法合成Met主要以丙烯醛、甲硫醇和氢氰酸为原料合成Met的外消旋体(D-和L-Met)，再通过外消旋体分离获得L-Met。尽管化学法工艺成熟，但仍存在其合成原料有毒，能耗高且过程复杂等问题。目前生物法合成Met的研究还在积极探索。生物法合成Met包括两种即酶法合成和生物发酵。目前酶法合成产量相对较高，约40g/L，但过程较为复杂，先通过发酵合成中间产物高丝氨酸，再通过将酶与发酵细胞产生的高丝氨酸以及底物甲硫醇催化合成Met。生物发酵法主要聚焦于对大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等自身Met合成途径进行改造，通过葡萄糖发酵直接产生Met，具体改造途径包括提高Met的合成前体天冬氨酸、高半胱氨酸等的合成，解除合成途径关键酶的反馈抑制如：天冬氨酸激酶、胱硫醚-γ-合酶等，减少竞争途径如赖氨酸和苏氨酸的合成，减少下游产物S-甲基甲硫氨酸的合成等。目前Huang等2018年最新研究表明，通过对整个代谢途径的改造包括还原力NADPH途径，天冬氨酸前体合成途径，竞争性的赖氨酸和苏氨酸合成途径和甲硫氨酸合成内部途径等多个步骤的改造，并经过在发酵罐中的连续发酵(连续发酵可使产量比摇瓶提高10-20倍以上)，甲硫氨酸的发酵水平已经达到16.86g/L，但是该研究仅局限于对大肠杆菌内部合成通路的改造和酶的过表达。尽管生物发酵法方法简单、能耗低、过程绿色无污染，但是距离工业化生产还有一定的距离。

目前尚未见生物法或酶法将植物中甲硫氨酸合成途径CGS及SMM循环关键酶应用到微生物中发酵合成甲硫氨酸的报道。

(三)发明内容

本发明在现有生物法合成甲硫氨酸的基础上，提供了一种提高甲硫氨酸产量的新的思路方法，具体是将植物甲硫氨酸合成途径特有的多酶组合应用到微生物，通过植物中的特异酶的过表达提高微生物中甲硫氨酸的含量，同时通过将微生物中苏氨酸的合成前体转化为甲硫氨酸，提高甲硫氨酸的含量。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种提高甲硫氨酸产量的方法，所述方法为：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸。所述宿主菌优选为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。