[发明专利]一种提高甲硫氨酸产量的方法

权利要求书

1.一种提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述方法为：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因或甲硫氨酸甲基转移酶基因中的一种或多种导入宿主菌构建重组基因工程菌，将重组基因工程菌发酵培养，获得含甲硫氨酸发酵液，发酵液分离纯化获得甲硫氨酸；所述胱硫醚-γ-合酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；所述同型半胱氨酸甲基转移酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；所述甲硫氨酸甲基转移酶基因核苷酸序列为SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述宿主菌为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

3.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法之一构建：(1)单酶体系：将胱硫醚-γ-合酶编码基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因分别插入到质粒pBlunt-E1上得到重组质粒pBlunt-E1-CGS、pBlunt-E1-HMT和pBlunt-E1-MMT；将重组质粒分别导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得相应的工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT、E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-MMT；(2)双酶体系：同时将同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入到质粒pBlunt-E1上，重组质粒pBlunt-E1-HMT-MMT；将重组质粒导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-HMT-MMT；(3)三酶体系：将胱硫醚-γ-合酶基因、同型半胱氨酸甲基转移酶基因和甲硫氨酸甲基转移酶基因串联插入质粒pBlunt-E1上，获得重组质粒pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT，将重组质粒分别导入大肠杆菌中获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)pBlunt-E1-CGS-HMT-MMT。

4.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌为共表达胱硫醚-γ-合酶和同型半胱氨酸甲基转移酶以及甲硫氨酸甲基转移酶的重组基因工程菌。

5.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌发酵培养方法为：将工程菌接种至发酵培养基中，在28℃、180rpm条件下进行发酵培养，获得含甲硫氨酸的发酵液，发酵液离心，分离纯化获得甲硫氨酸；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，NaS₂O₃ 16g/L，酵母粉2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 1g/L，CaCO₃ 10g/L，FeSO₄0.01g/L，MnSO₄ 0.01g/L，ZnSO₄0.01g/L，溶剂为水，pH自然。

6.如权利要求1所述提高甲硫氨酸产量的方法，其特征在于所述重组基因工程菌发酵前先进行诱导培养，具体如下：将重组基因工程菌接种于含有终浓度100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养过夜，取培养物以体积浓度1-2％的接种量转接于含有100μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，向培养物中加入终浓度0.5mM的IPTG，在25℃，140rpm下诱导培养14h，然后于4℃和5000rpm离心收集湿菌体，并用发酵培养基重悬湿菌体洗涤2次，将湿菌体以1g/50ml的量接种至发酵培养基进行发酵。