[发明专利]一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用

说明书

本发明公开了一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用。所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；采用CRISPR/Cas9技术，设计了2个sgRNA靶位点，分别位于距离终止密码子（TGA）236bp和230bp，通过转化烟草造成该基因在目标位点的突变；通过自交收种后，筛选得到了NtMYB44a基因定点纯合突变后代。生理实验表明突变烟草叶片失水速率显著慢于野生型的对照植株。干旱胁迫后的覆水实验表明突变植株存活率显著高于野生型植株。本发明表明利用CRISPR/Cas9技术针对NtMYB44a基因尾部（即距离NtMYB44a翻译终止密码子（TGA）200bp至300bp序列范围）所创制出的NtMYB44a基因纯合突变烟草材料比野生型烟草具有更高的抗旱能力。本发明为NtMYB44a基因及其编码蛋白应用于烟草抗旱育种提供基因资源与技术支持。

技术领域

本发明属于烟草遗传技术领域，具体涉及一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用。

背景技术

MYB44 是植物典型的 R2R3-MYB 转录因子，在不同物种间基因结构保守，可转录调控植物对干旱和盐等胁迫的抵抗能力。研究表明，MYB44是水杨酸（salicylicacid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）、生长素（Auxin）和赤霉素（gibberellin，GA）信号途径共同的转录因子，参与上述激素信号途径的交互作用，对微生物、真菌、钙离子信号、盐和干旱等生物和非生物胁迫有所响应。

植物体内ABA 含量增加积累与植物抗旱强弱有关，其含量可作为抗旱性鉴定的评价指标之一。ABA在干旱等逆境胁迫下的生理功能主要有两方面:一是ABA在水分平衡方面的作用主要是通过控制气孔开度来实现的，二是细胞耐受功能则是通过一系列胁迫相关基因的表达实现的。用ABA处理拟南芥后，AtMYB44转录水平明显增加，并且在导管和叶片气孔中高效表达。MYB44在ABA信号转导中的作用机制为脱落酸信号受体PYL8与MYB77和MYB44形成蛋白复合体，促进MYB44结合下游靶标基因启动子区的MBSI基序，从而调控ABA响应基因表达。此外，At-MYB44通过抑制ABA的负调控因子PP2Cs（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2C家族）来对ABA进行正向调控。Li等2014采用免疫共沉淀技术（pull down）和酵母双杂交技术证明AtMYB44转录因子N端54-105氨基酸与ABA受体RCAR1具有直接互作作用。

目前对CRISPR/Cas系统的优化改进的研究成果不断涌现，主要集中在利用CRISPR/Cas系统实现多个基因同步编辑/敲除和提高CRISPR/Cas系统的精确性，减少脱靶率，从而降低细胞毒性和潜在风险。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a；第二目的在于提供所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法；第三目的在于提供所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的应用。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明的第二目的是这样实现的，包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；