[发明专利]一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a及其定点突变方法与应用

权利要求书

1.一种能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求1或2所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于包括以下步骤：

A、烟草叶片cDNA合成：提取烟草叶片总RNA，反转录得到第一链cDNA；

B、PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据NtMYB44a基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序；

C、NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的构建：根据基因序列设计靶位点sgRNA序列，合成sgRNA引物序列，将sgRNA序列通过酶切和连接进pORE-CRISPR/Cas9植物表达载体；

D、NtMYB44a基因突变测序检测：根据NtMYB44a基因序列设计特异性检测引物，通过高保真DNA聚合酶扩增NtMYB44a的基因序列片段，通过Sanger测序方法测序PCR产物，与NtMYB44a基因序列进行比对，如果在靶位点sgRNA序列后出现双峰即为突变成功。

4.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于B步骤中所述的引物为：

正向引物 ：5’- ATGGCCAATAGCAGTAACAGTTC -3’

反向引物 ：5’- TCAATTGAACTCTCTCAAAAGTGGTAGTG -3’。

5.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于C步骤中所述的构建突变NtMYB44a基因的CRISPR/Cas9载体的靶位点sgRNA序列为：

sgRNA1序列：5’- ACCTCCACCACCGCCGCCTC-3’

sgRNA2序列：5’- ACCACCGCCGCCTCAGGCTG-3’。

6.根据权利要求3所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的定点突变方法，其特征在于D步骤中所述的检测NtMYB44a在靶位点后出现突变的特异性引物为：

正向引物：5’-CGTCATCATCTCAATCTCACTTGT-3’

反向引物：5’-CTGCTGTTGTTGCTGCTGAA-3’。

7.一种权利要求1或2所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a的应用，其特征在于所述的能提高烟草抗旱的转录因子NtMYB44a在获得抗旱转基因烟草植株中的应用。