[发明专利]一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂及其应用

权利要求书

1.一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂，其特征在于，所述诱导剂包括：15～25份水溶性多肽、50～70份溶剂、5～15份渗透剂、5～15份稳定剂，所述水溶性多肽提取自青霉菌灭活菌丝体；

所述水溶性多肽的制备方法为：

a.将青霉菌灭活菌丝体用盐析法提取多肽粗提物：

1）将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入预混池，按照残渣：硅藻土质量比为10:1～10：3的比例加入干燥的硅藻土，搅拌混合均匀；

2）将上述预混合料80℃～110℃鼓风干燥灭活0.5～2.5小时；

3）干燥后的混合料每50～100克用1升蒸馏水溶解，用八层纱布或双层棉布过滤除去不能溶解的残渣，将过滤得到的澄清液体倒入大烧杯；

4）向大烧杯中缓慢加入硫酸铵，边加入边搅拌溶解，至硫酸铵浓度达到80%～100%，将溶液静置8～16小时至有沉淀物析出，此时溶液呈悬浊状态，将悬浊液倒入离心管，3000rmp离心，弃掉上层液体，取沉淀；

5）每1克沉淀用50～100毫升蒸馏水溶解，用截留分子量小于3kd以下的滤膜超滤或透析除盐；

6.）除盐后的溶液可作为储备液于4℃保存，如需长期保存，可用氮气吹干，即获得所需的干燥多肽粗提物；

b.将步骤a中的多肽粗提物经过三级分离和活性筛选得到所述水溶性多肽浓缩干燥样品；

所述多肽粗提物的三级分离和活性筛选方法为：

（1）一级分离：将多肽提取物缓冲液溶解，12000 rpm，10 min离心取上清，0.45μm滤膜过滤，滤下液备用；用ÄKTA pure层析系统，Hiload 16/60 Superdex 30 prep grade预装柱对上述滤下液进行分离制备，每次进样3mL，用缓冲液1 mL/min等度洗脱1.8个柱体积，280nm检测，分段收集馏分；

所述缓冲液为pH 7.6，150 mmol/L乙酸铵；

（2）活性组分筛选：对各分离组分进行心叶烟诱导处理，进行枯斑抑制率对比试验，筛选诱导活性强的组分；

各个一级分离组分用去离子水溶解，分别配制成1 mg/mL工作液用于烟草诱导处理，将配制好的各个一级组分分别均匀涂抹在心叶烟下位三片叶的叶片上表面，每片叶涂抹100μL，对照用100μL清水涂抹叶片，每个处理3株烟，重复三次；

（3）二级分离:将筛选出的一级组分用含0.1%TFA的超纯水溶解，12000 rpm离心10min，上清用0.22μm滤膜过滤；

再将所得的样品组分用Agilent 1260高效液相色谱系统，Zorbax 300SB-C18色谱柱对活性较强组分进行二级分离纯化，合并相同组分；

（4）活性组分筛选：将各个二级分离组分用去离子水溶解，分别配制成1 mg/mL母液用于烟草BY-2细胞诱导处理，分别用终浓度为5μg/mL的各个二级分离组分处理烟草BY-2细胞，空白对照用等体积无菌水处理，用终浓度为1μmol/mL的flg22处理细胞作为阳性对照，进行ROS检测；

（5）三级分离和活性筛选：将有明显诱导活性的二级组分进行进一步分离纯化，色谱柱为Zorbax 300SB-C18，流动相A为0.09%TFA+99.91%甲醇，流动相B为0.1%TFA+99.9%超纯水，每次进样体积50μL，检测波长为280 nm，参照二级组分各自的出峰时间及洗脱梯度，流速2mL/min，按照峰型分段收集，收集到的各个组分利用BY-2细胞进行诱导抗病效果检测，将诱导抗病效果最佳的组分进行收集得到水溶性多肽的水溶液，进一步对水溶性多肽干燥得到水溶性多肽样品。

2.根据权利要求1所述的一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱

导剂，其特征在于，所述溶剂为水，所述渗透剂为氨基磺酸钠或吐温，所述稳定剂为氨基酸碱类物质。

3.根据权利要求1所述的一种提高烟草抗病性的水溶性多肽诱导剂在抗烟草花叶病毒及抗烟草黑胫病病毒中的应用。