[发明专利]一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。本发明提供一种转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液，所述培养液包含基础培养液和p53蛋白小分子激动剂；所述p53蛋白小分子激动剂包括RITA、CTX1、Nutlin‑3中的一种或多种。本发明还提供利用所述培养液提高基因编辑的同源修复效率的方法。通过在转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中添加p53蛋白的小分子激动剂，极大地提高了基因编辑过程的同源修复效率，进而提高了基因编辑效率，有效降低了阳性细胞的筛选工作量，同时具有操作简便、成本低等优势，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。

背景技术

在细胞或活体水平上进行遗传缺陷的修复，已经成为疾病的细胞治疗、新药开发、动物表型改善的重要手段。在动物的细胞治疗中，通过收集动物的活体细胞、在体外进行分离培养、利用基因编辑技术修正缺陷基因、质量控制后回输到动物体内，进而达到治疗某些疾病的目的。随着技术水平的不断提高，细胞治疗已经成为现代医学的重要发展方向。动物基因编辑主要用于获得生产性能提高的动物新品种、无免疫排斥基因或蛋白或组织器官(实现人源化)、生物活性物质(生物提取制药)等高附加值产品，如生物制药中的动物生物反应器、用于异种移植治疗器官衰竭的人源化器官生产、抗烈性传染病的畜禽新品种培育等诸多领域。目前已经获得的具有优良性状的基因编辑动物包括白化的基因编辑五指山猪、细毛产量明显增加的基因编辑羊、产肉性能与国际著名肉牛品种相当的基因编辑鲁西黄牛等，这些优良性状的获得是常规育种数十年都难以实现的，由此可见，基因编辑技术具有巨大优势和应用价值。

在疾病治疗或动物遗传育种的基因修复或定点插入新基因的过程中，如何进行高效修复与定点整合是制约治疗用细胞或基因编辑动物规模化生产的主要瓶颈。CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前动物基因编辑的主要方法，目前的研究主要侧重于Cas9蛋白的功能与活性、编辑效率和脱靶性等方面，而关于基因编辑修复的研究较少，多数方法仍完全依赖细胞自身的修复系统实现修复，缺乏人为干预和控制方面的研究，因此，基因编辑修复效率的提升十分有限。目前，利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的同源修复效率仅为0.1％-5％，较低的同源修复效率大大增加了获得基因编辑纯合子的细胞筛选的工作量，增加了基因编辑筛选和鉴定工作的人力和物力消耗。因此，亟需开发提高同源修复效率的基因编辑方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。

p53基因是动物体内的抑癌基因，是细胞生长周期的负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。RITA、CTX1和Nutlin-3是以p53蛋白为靶标的抑癌药物，在细胞内作为p53蛋白的小分子激动剂，以不同的方式与p53蛋白或p53蛋白信号通路蛋白相互作用，促进p53蛋白发挥功能。发明人在进行细胞基因编辑的研究过程中，根据细胞DNA的修复机制以及细胞周期的调控机制，结合生物信息学分析，对于影响DNA同源修复的物质进行了大量的筛选，意外地发现RITA、CTX1和Nutlin-3的体外添加对于人为、有目的地进行细胞基因编辑时的同源修复效率具有显著的提升作用。

首先，本发明提供RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种在细胞基因编辑中的应用，为通过将RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种添加至转染后培养基因编辑细胞的培养液中实现。

本发明中，所述基因编辑为通过同源修复实现的精准基因编辑。

本发明中，通过同源修复实现的基因编辑可以为任意一种利用人工手段、在进行靶基因的替换、缺失、插入等各种基因突变过程中涉及同源修复的基因编辑；可以通过任意的基因编辑方法实现，例如：CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的基因编辑，利用锌指核酸内切酶(ZFN)介导的基因编辑，类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因编辑。