[发明专利]一种梯度pH法制备胸苷的方法

说明书

本发明涉及一种梯度pH法制备胸苷的方法，以DNA水解液为底物与胸腺嘧啶混合，以固定化大肠杆菌细胞为催化剂反应制备胸苷，在制备过程中通过利用梯度pH法加入磷酸盐缓冲液调节体系反应前期、反应后期的pH值，可有效提高反应速率，大大缩短反应时间；利用包埋‑交联法制备固定化大肠杆菌，较好的提高了菌体对底物的耐受性，其中添加的活性炭能降低固定化大肠杆菌的内扩散阻力，有利于物质在固定化大肠杆菌中的扩散，有效提高反应速率，且固定化大肠杆菌细胞操作稳定性好，重复利用性高；采用本发明方法制备胸苷的工艺简单，转化率较好，收率达61％以上，提纯后胸苷纯度可达96％以上。

技术领域

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种梯度pH法制备胸苷的方法。

背景技术

胸苷是抗艾滋病有效治疗药物齐多夫定和叠氮胸苷的重要原料，在抗病毒、抗肿瘤方面起到了不可替代的作用。目前胸苷的生产方法主要有四种：化学合成法，DNA酶解法，发酵法和酶法。

化学合成法有多种途径，但是其在制备胸苷的过程中糖苷键缺乏立体专一性，原料不易得，且胸苷收率非常低，而且生产过程中有大量废水产生，环境污染大。发酵法是利用微生物培养使其在培养基中积累胸苷，虽然能够规模且单一地生产胸苷，但该方法周期长、易染菌、收率低。酶法是以2′-脱氧核苷和胸腺嘧啶为原料，以菌体或酶为催化介质，催化得到胸苷，尽管酶法具有专一性强、操作简单、反应时间短等优点，但是原料2′-脱氧核苷价格昂贵。目前工业制造主要是以DNA酶解后所得2′-脱氧核苷混合液为原料，但是这种方法受反应平衡的限制，收率较低。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有酶法制备胸苷技术的不足，以DNA水解液(即2′-脱氧核苷混合物)为原料，采用梯度pH法，经酶法转化，提高反应阶段的转化率及缩短反应时间；并利用包埋-交联法对大肠杆菌菌体进行固定，解决目前菌体易于受底物抑制，转化率低的问题，同时提高菌体重复使用率。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：以DNA水解液为底物和胸腺嘧啶混合，以固定化大肠杆菌细胞为催化剂反应制备胸苷，在制备过程中加入磷酸盐缓冲液，采用梯度pH法调节体系反应前期pH为弱酸性，反应后期调节体系pH为弱碱性。

本发明通过如下方案实现：

将DNA水解液和胸腺嘧啶混合，在反应前期加入磷酸盐缓冲溶液并调节体系pH值为5.0～6.0，加入固定化大肠杆菌细胞，在此弱酸性体系下于50～70℃反应2.0～2.5h，反应后期调节体系pH值为7.5～8.5，在此弱碱性体系下反应1.5～2.0h，反应结束；将反应液置于4℃冰箱2～5d，过滤，弃去滤渣，加入活性炭脱色，过滤得到透明液体，减压蒸干，得到微黄色固体粉末；然后用硅胶柱进行等度洗脱分离，制得白色晶体胸苷。

进一步地，所述DNA水解液在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为30～100mmol/L，固定化大肠杆菌细胞的质量浓度为80～200g/L，胸腺嘧啶浓度为DNA水解液浓度的3倍。

进一步地，所述磷酸盐缓冲溶液的pH为7.0。

进一步地，所述固定化大肠杆菌细胞采用包埋-交联法以PVA和卡拉胶为包埋有机材料、活性炭为添加剂、饱和硼酸和KCI溶液为固定剂溶液制得，具体为：

①将PVA浸泡在水中，加入卡拉胶，加热使两者充分溶解并灭菌，得到混合溶液并待用；

②将大肠杆菌种子接种于液体培养基中，依次经过培养、离心、洗涤和再次离心，得到大肠杆菌细胞；

③将步骤②的大肠杆菌细胞和灭菌活性炭加入到步骤①中的混合溶液中，混匀后，滴加灭菌固定剂溶液进行成型，得到固定化大肠杆菌细胞。

进一步地，所述混合溶液中PVA、卡拉胶、水的质量比为3:0.3:50；所述大肠杆菌细胞和活性炭的质量比为5:1，大肠杆菌细胞在所述混合溶液中的质量浓度为1g/L。