[发明专利]一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法

说明书

本公开涉及一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法。具体来说，本公开的方法包括将重组核酸分子插入质粒或表达载体中从而构建重组质粒或重组表达载体的步骤。本公开的方法进一步包括将所述重组质粒或重组表达载体转染至李斯特菌中的步骤。本公开的方法既可提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的表达，又能促进或维持非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白的功效，进一步提高非整合减毒李斯特菌疫苗在临床应用中的价值。

技术领域

本公开主要涉及生物技术领域。具体来说，本公开提供一种提高菌株的蛋白质表达的方法。更具体来说，本公开提供一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法。

背景技术

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种常见食源性肠道病原菌，类属革兰氏阳性、短杆状、无芽孢、兼性厌氧胞内寄生菌[1]。单增李斯特菌可通过直接或内化作用被抗原提呈细胞吞噬，引起产生MHCⅡ途径介导的CD4+T细胞免疫反应和MHCI途径介导的CD8+T细胞免疫反应[2]。此外，单增李斯特菌亦可借助自身内化素蛋白(InlA)和粘附蛋白(LAP)与宿主上皮细胞相互作用，使其进入血液循环系统而引起产生细胞免疫反应[3]。

基于单增李斯特菌特有的免疫和繁殖特性，利用减毒LM菌株为载体，将人乳头瘤病毒HPV16E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、黑色素瘤相关抗原HMW-MAA、前列腺特异抗原PSA、间皮素(mesothelin)、抑癌蛋白P53等不同特异性病毒抗原或肿瘤抗原为目的的特异性核酸片段插入李斯特菌中，制备李斯特菌疫苗，促使李斯特菌能在宿主细胞内表达特异性抗原蛋白，通过MCHI和MCHⅡ途径，特异性激活CD4+和CD8+T细胞免疫反应，可以达到治疗肿瘤的作用。当前，国际社会以人乳头瘤病毒HPV16E7为代表的部分李斯特菌疫苗已进入临床试验阶段。

将李斯特菌更安全性的应用于临床，一般需以减毒的李斯特菌作为基础载体。整合性构建的李斯特菌疫苗，构建周期长，整合筛选流程复杂繁琐，构建成本较高。由于非整合李斯特菌可通过构建表达质粒以表达目的抗原蛋白，在李斯特菌疫苗构建方式中，其具有周期短、流程简单快捷、筛选方便、临床应用安全性高和成本低等特点，是一种独特的疫苗构建方式。但在非整合疫苗构建过程中，仍会存在目的抗原蛋白表达水平低甚至不表达，以及表达抗原蛋白性质不稳定、功效应用价值低等缺点[4]，所以急需探索一种新方法以提高非整合李斯特菌目的抗原蛋白的表达而生物活性不受抑制。

为增强非整合细菌抗原蛋白的表达，通常会在表达融合蛋白中设计和添加一组蛋白连接肽(Linker)，以促进或维持抗原蛋白的表达和生物活性[5]。但是，蛋白连接肽的成分和组成会影响目的抗原蛋白的表达甚至生物活性，一般选择Ala、Gly、Thr或Ser为成分的低疏水性和低电荷效应的柔性蛋白作为蛋白连接肽的基本成分，以期增强目的抗原蛋白的表达而生物活性不会受到抑制[6]。

由于现有方案中仍然存在以上问题，因此，需要提供一种提高非整合减毒李斯特菌外源抗原蛋白表达的方法，进而解决目的抗原蛋白表达水平低甚至不表达、以及表达蛋白抗原性质不稳定、生物活性差等问题。

现有技术文献

[1]Laurel L.Lenz,William A.Huang,Chenghui Zhou,et al.Stableintegration vector for nutrient broth-based selection of attenuated Listeriamonocytogenes strains with recombinant antigen expression[J].Clinical andVaccine Immunology,2008,15(9):1414-1419.