[发明专利]一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种L‑天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明在天然L‑天冬酰胺酶的基础上，通过定点突变生物技术改造L‑天冬酰胺酶分子结构，L‑天冬酰胺酶突变体的纯酶液酶活提高至2037.13U/mg，较原始酶酶活(约1483.81U/mg)相比提高了约37.3％。本发明表明第22位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的在食品行业中的应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术和酶工程领域。

背景技术

L-天冬酰胺酶能够通过水解脱氨基反应将L-天冬酰胺催化形成L-天冬氨酸和氨。目前Escherichia.coli，Erwinia chrysanthemi及Erwin-ia carotovora等微生物来源的L-天冬酰胺酶已经被广泛应用于治疗多种疾病，如急性淋巴白血病和淋巴肉瘤等。但是，该酶的半衰期短、酶活性低、具有副催化反应等缺陷导致在临床应用时会出现一些较严重的不适应性。

食品行业中，利用L-天冬酰胺酶处理食品，常使用“热烫法”，即将食品置于较高温度(如95℃)的水中，并加入L-天冬酰胺酶通过酶反应来降低食品中L-天冬酰胺的含量。由于L-天冬酰胺是致癌物质丙烯酰胺的主要前体物质，因此通过在食品预加工时加入L-天冬酰胺酶，可以有效降低高温加工食品中的丙烯酰胺含量(LWT-Food Science andTechnology,2011,44(6):1473-1476；Molecular NutritionFood Research,2009,53(12):1532-1539；EXTREMOPHILES，2015,19(4))。

为了提高L-天冬酰胺酶在工业中的应用潜力，满足工业生产需求，我们需要不断寻找具有较好的热稳定性以及更高酶活的L-天冬酰胺酶，使其能在复杂的食品加工处理过程中保持较高的酶活，提高“热烫法”的应用效率。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，所述突变体通过将出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的第22位氨基酸进行突变得到的。将以编码此突变体的基因为目的基因、以pMA5-E22K为表达载体、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168为表达宿主构建得到的重组枯草芽孢杆菌工程菌发酵24h，可使得发酵液中L-天冬酰胺酶的酶活提高至2037.13U/mg。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的L-天冬酰胺酶的第22位氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的L-天冬酰胺酶的第22位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸得到的；

在本发明的一种实施方式中，所述L-天冬酰胺酶的来源为嗜热嗜压古菌(Pyrococcus yayanosii CH1)。

本发明提供了编码上述一种酶活提高的L-天冬酰胺酶突变体的基因。

本发明提供了携带上述基因的重组表达载体。

本发明提供了一种表达所述L-天冬酰胺酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以枯草芽孢杆菌为宿主。

本发明提供了所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的基础上，将编码第22位的谷氨酸的密码子突变成编码赖氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到枯草芽孢杆菌宿主菌中即得到枯草芽孢杆菌基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pMA5-E22K。