[发明专利]一种连续体积梯度毛细管数字PCR装置及其使用方法

说明书

本发明提供了一种连续体积梯度毛细管数字PCR装置，该装置包括：一个可编程热循环仪、一套横截面大小连续变化的毛细管和一个光学信号采集设备。本发明可以在节约成本的同时，简化数字PCR的操作步骤，且能达到较高的DNA定量精确度。

技术领域

本发明涉及数字PCR领域，特别涉及一种连续体积梯度毛细管数字PCR装置及其使用方法。

背景技术

现代生物学研究，特别是医学研究时常涉及对核酸定量分析的需求。比如检测血液中某些游离DNA及其含量，可以指导某些癌症的临床诊断，以及监控癌症的治疗效果。以往的定量主要采取荧光定量PCR进行相对定量，即选取一个表达稳定的基因的转录物作为参照，来评判目的核酸的量的高低。但这种方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干扰，只适用于定性或者低精度检测，无法满足某些含量特别稀少的目标核酸分子的检测。

数字PCR(dPCR)则能通过大规模的平行PCR扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中提炼出来，以“终点信号的有或无”来统计被扩增的分子的个数。近几年来，随着纳米制造技术和微流体技术的发展，及二代测序技术发展起来的“油包水PCR”技术，可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的单个油包水微滴，以此作为dPCR的样品分散载体，而产生的微滴式数字PCR(ddPCR)技术，是目前相对成熟的数字PCR平台。

一方面，ddPCR需要借助微滴发生器来实现均匀微滴的生成，将微滴转移到96孔板进行PCR后，又需要微滴分析仪进行信号读取。该过程涉及的仪器价格较高，普通实验室难以承受。

另一方面，由于数字PCR是根据阳性液滴个数来统计模板拷贝数的，数字PCR中每个液滴中模板的拷贝数不能太高也不能太低，太高会造成最终统计拷贝数偏少，太低又会导致统计误差过大，统计学上最完美的是1个或者0个。为了调试实验模板用量，主流数字PCR(包括ddPCR)都需要做预实验来确定实验模板用量；对于一些十分珍贵的核酸材料，做预实验的成本将非常高，甚至根本不够做一次预实验。

发明内容

为了解决现有技术中成本高和需要做预实验的问题，本发明提供了一种连续体积梯度毛细管数字PCR装置。

本发明提供了一种毛细管，其内径由大到小连续变化，其特征在于：所述毛细管细端内径为10～50μm，粗端内径＜1mm，毛细管长度为0.8～4cm。

本发明还提供了前述毛细管在数字PCR中的用途。

本发明还提供了一种连续体积梯度毛细管数字PCR装置，其特征在于，该装置包括：

一个可编程热循环仪；

如前所述毛细管；

一个光学信号采集设备。

进一步地，所述可编程热循环仪是PCR仪；和/或，前述荧光信号采集设备是荧光显微镜。

本发明还提供了前述装置的使用方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)将含荧光基团的PCR反应体系和与水等密度油相按照1：(2～4)的比例震荡混匀，置入内径由大到小连续变化的毛细管中，封闭毛细管两端；

(2)加热使油相和水相沿毛细管径向交替分布；

(3)进行PCR反应，光学信号采集设备下统计阳性微滴占比30％～50％区域的微滴数和微滴半径，计算PCR模板拷贝数。

前述的方法，其特征在于，步骤(2)加热条件为，95℃下维持10min。

前述的方法，其特征在于，所述PCR反应体系和与水等密度油相的比例是1∶3(v/v)。

前述的方法，其特征在于，所述油相为蓖麻油与石蜡油按3∶1(v/v)比例混合，再用该混合物配制胆固醇饱和溶液，即得。