[发明专利]一种提高青花菜离体再生效率的组织培养方法

说明书

本发明公开了一种提高青花菜离体再生效率的组织培养方法，该方法选取青花菜花球成熟期的外叶作为外植体，消毒灭菌后切成小块接种到诱导培养基上，使用红白组合光(白光：红光＝3:1)光照处理；将诱导出的不定芽转接在增殖培养基上进行继代增殖；取幼苗转接到生根培养基上诱导生根，获得生根苗。本发明根据外植体特点，通过培养基不同激素配比、光照处理建立了青花菜高效的再生体系，该方法具有取材便宜、不定芽诱导快、繁殖效率高等优点。

技术领域

本发明涉及一种以青花菜花球成熟期的外叶为外植体，建立高效的离体再生技术体系的方法，属于生物技术领域。

背景技术

青花菜，别名绿菜花、西兰花、茎椰菜、意大利芥蓝，属十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，以其主茎和侧枝顶端形成的花球供食用。青花菜富含多种维生素和矿物质，尤其含有丰富的防癌和抗癌物质莱菔硫烷（sulforaphane，SF 或 SFN）。近年来，青花菜种植面积在我国迅速扩大，成为我国重要的出口蔬菜。但是目前生产上使用主栽品种的约90%皆为进口品种，种质资源匮乏是限制我国青花菜品种选育的关键问题之一。

目前生产上的商品种基本上为雄性不育系配制的杂交种，在找到较好的保持系或恢复系之前，对其进行离体保存是种质资源保存的必需环节。国内外对于青花菜的离体保存，其中利用花蕾、花器官、叶片、带柄子叶及腋芽作为外植体进行组织培养研究均有过报道，但不同基因型、不同外植体间的再生频率差异很大。其中利用叶片作为外植体的研究中所用叶片系取自植株的腋芽所发生的叶子,但又因多数品种不发生腋芽或腋芽较少而存在困难（李曙轩和裘文达，1983）。本研究利用青花菜花球成熟期的外叶作为外植体，建立了一种更为简单、高效、通用的离体再生技术体系，为雄性不育系、自交不亲和系，以及接籽困难青花菜材料的无性繁殖和扩繁提供了更适用的方法。

发明内容

本发明以青花菜花球成熟期的外叶作为外植体，根据外植体特点，在现有组织培养中常规技术的基础上，通过试验研究，对多个技术环节分别进行单因素和多因素试验，对再生技术体系进行调整、改良，提出了一套系统的创新体系，达到了一个良好的效果。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

1）外植体选择

取青花菜花球成熟期的外叶，采用体积分数75%的乙醇对其灭菌1~2 min，然后用体积分数8~9 %的次氯酸钠消毒15~20 min，最后用无菌水冲洗3~4次。灭菌后，将叶片切成边长为1.0～1.5 cm的方块；

2）分化诱导

把外植体接种到MS培养基上，置于温度为25±0.5 ℃，每天光照时间为14h的培养室中培养，15～20 d可直接诱导出不定芽；

所述诱导培养基为MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+6~7 g/L琼脂 + 25~30 g蔗糖, pH5.8；

所述光照条件为白光灯：红光灯=3:1；

3）继代增殖

将诱导产生的单芽或丛生芽（丛生芽切割成单芽）转接到继代增殖培养基上，25~30 d转接一次，经过3~4次的继代，芽的倍数可达200倍左右的增殖；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14 h/d，培养温度为25±0.5 ℃；

所述继代增殖培养基为MS+0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+6~7 g/L琼脂+25~30 g蔗糖, pH5.8；

4）生根诱导

幼芽生长至3~4 cm高时，将其转接到生根培养基上，15~20 d可诱导生根，获得生根苗；期间光照培养环境为：白光，光照时间为14 h/d，培养温度为25±0.5 ℃；