[发明专利]一种提高甲壳素酶表达量的方法

说明书

本发明公开了一种提高甲壳素酶表达量的方法，属于酶工程以及微生物工程技术领域。本发明的方法为先将信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ的基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因N端，然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达，以提高甲壳素酶的表达量；将利用本发明的方法得到的重组菌发酵12h，可使得发酵上清液中的甲壳素酶酶活提高至20.62U/mL(胞外酶活)，是野生型菌株发酵的将近15倍。

技术领域

本发明涉及一种提高甲壳素酶表达量的方法，属于酶工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

甲壳素酶(EC 3.2.1.14.)又称几丁质酶，能催化不溶性的甲壳素糖链β-1,4糖苷键的断裂，生成水溶性的几丁寡糖。

由于甲壳素酶既可作为生物防治剂，也可用于原生质分离、细胞化学定位以及生产单细胞蛋白，因此，其在农业、生物技术方面均有很重要的应用；由于甲壳素酶的水解产物几丁寡糖能够提高机体免疫力、抑制肿瘤细胞生长、在人体肠道内活化增殖双歧杆菌、抗菌防腐、保湿，因此，其在医药、食品、化妆品等工业中也具有广阔的应用前景。

现在，已发现的能够产甲壳素酶的微生物主要包括Paenibacillusbarengoltzii、Marine Bacterium(Alteromonas sp.Strain 0-7)、Streptomycesthermoviolaceus OPC-520和Bacillus cereus等，但是，这些野生菌株的甲壳素酶产量均十分低下，仅有0.83-1.13U/mL。

目前，已经有研究通过异源表达、酶分子改造等技术手段试图提高甲壳素酶表达量，例如，在大肠杆菌或毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因以及通过定点突变或以随机突变的方式改造甲壳素酶的底物结合结构域和催化结构域以提高酶活，但是，在大肠杆菌中异源表达甲壳素酶基因易形成包涵体；在大肠杆菌以及毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因时，甲壳素酶为胞内分泌，因此，提取甲壳素酶需破壁导致酶活损失；在毕赤酵母中异源表达甲壳素酶基因操作复杂、培养周期长；以随机突变的方式改造甲壳素酶的底物结合结构域和催化结构域以提高酶活具有随机突变的不确定性，因此，会导致的筛选困难，上述技术均并不能够真正运用于工业生产。

因此，急需找到一种新的可克服表达量低、易形成包涵体、破壁导致酶活损失等缺陷且可大幅度提高甲壳素酶表达量的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种提高甲壳素酶表达量的方法。此方法为先将信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ的基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因N端，然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达，以提高甲壳素酶的表达量；将利用此方法得到的重组菌发酵12h，可使得发酵上清液中的甲壳素酶酶活提高至20.62U/mL(胞外酶活)，是野生型菌株发酵的将近15倍。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种提高甲壳素酶表达量的方法，所述方法为先将外源信号肽基因融合至切除了自身信号肽基因的甲壳素酶基因(chisb)N端；然后将融合有外源信号肽基因的甲壳素酶基因在表达宿主中进行表达；

所述外源信号肽为信号肽NprB、AmyE、AprE、BglS、Bpr、Epr、LipA、Vpr、YweA或YclQ。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将甲壳素酶基因的自身信号肽基因切除，得到缺失自身信号肽的甲壳素酶基因(chisb-sp)；然后将外源信号肽基因融合至缺失自身信号肽的甲壳素酶基因的N端，得到融合基因；然后将融合基因与表达载体相连接，得到重组载体；最后将重组载体转化至表达宿主中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，所述外源信号肽来源于枯草芽孢杆菌168。