[发明专利]用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒

说明书

本发明提出一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒，属于基因工程领域，提出了一种通过转基因技术提高烟草对黑胫病抗性的方法。该技术方案包括通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性。本发明利用转基因技术得到稳定遗传的抗性接种植株，提高了烟草体内防御酶的活性，增强了烟草对黑胫病的抗性，该方法不影响烟草的生长，并且提高了烟草的抗旱性和耐盐性，大大降低了农药的使用量，减少了对环境的污染。

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒。

背景技术

烟草黑胫病是危害烟草生产的重要病害之一，在世界各产烟区普遍发生，也是危害我国烟叶生产的最主要病害。烟草黑胫病是土传性的真菌病害，由于其发病率高、传播快、难控制等特性，易对烟草生产造成严重经济损失，因此，各产烟区对该病的防治高度重视。化学防治仍是烟草黑胫病的主要防治手段。但是，化学防治会造成农药残留、污染环境、影响健康等危害。因此，非常有必要培育出对环境友好的抗烟草黑胫病的优良抗性品种，以促进我国烟草产业的可持续发展。

目前，随着分子生物学的发展，通过转基因技术提高植物自身的抗病性已成为行之有效的手段，为烟草抗黑胫病的分子育种提供新的思路。众多研究发现，油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)在植物的生长发育和调控植物抵抗非生物胁迫方面发挥着重要的作用。CYP85A1基因编码的酶是内源BRs合成的关键限速酶之一，作用于内源BRs生物合成中的C-20羟基化过程，过量表达该基因可以有效地调控内源BRs的生物合成量。然而，在烟草抗病分子研究过程中，关于内源BRs合成途径的关键酶基因参与烟草抵抗黑胫病的研究尚未开展，有待于进一步研究。

发明内容

本发明提出一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒，该方法可在不影响烟草生长并且提高抗逆性的前提下，增强烟草对黑胫病的抗性。

为了达到上述目的，本发明提出了一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性。

作为优选，所述过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系由以下方法得到：

根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物，利用所述特异性引物扩增得到PCR产物，将所述PCR产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体，将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后采用农杆菌介导的烟草叶盘方法将SoCYP85A1基因转入烟草中，筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系。

作为优选，所述根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

作为优选，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株具体包括：

将过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草植株的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

作为优选，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性具体包括：