[发明专利]用于提高烟草黑胫病抗性的方法、特异性引物及试剂盒

权利要求书

1.一种用于提高烟草黑胫病抗性的方法，其特征在于，通过转基因技术获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系，利用所述转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性；

所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株提高烟草对黑胫病的抗性具体包括：

所述抗性接种植株在接种烟草黑胫病原菌后，抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量提高，生成由SoCYP85A1基因编码的内源油菜素甾醇合成的关键限速酶，利用关键限速酶调控油菜素甾醇的生物合成量，通过提高烟草体内防御酶的活性来提高烟草对黑胫病的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系由以下方法得到：

根据SoCYP85A1基因序列设计特异性引物，利用所述特异性引物扩增得到PCR产物，将所述PCR产物连接至植物表达载体pB7WG2D,1中，获得含有目的基因的重组载体，将重组载体转入农杆菌感受态细胞中，然后采用农杆菌介导的烟草叶盘方法将SoCYP85A1基因转入烟草中，筛选再生植株，获得过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草株系。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述根据SoCYP90B1基因序列设计特异性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用转基因烟草株系继代培养获得的稳定遗传的抗性接种植株具体包括：

将过量表达SoCYP85A1基因的转基因烟草植株的T₀代植株进行继代培养，每一代均进行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR检测和GFP蛋白检测，并保留阳性植株进行继代培养，其中，T3代植株的PCR检测和GFP蛋白检测均呈阳性，可以进行稳定遗传，因此，将T₃代植株中的L₃和L₅转基因株系作为抗性接种植株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接种植株接种烟草黑胫病原菌包括以下步骤：

对培养至7叶期的野生型烟草和抗性接种植株的茎基部注射接种烟草黑胫病原菌，光照培养箱中培养，观察记录发病情况。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接种植株的SoCYP85A1基因表达量通过以下方法测得：

取所述接种烟草黑胫病原菌前和接种4d后的抗性接种植株的叶片，提取RNA，以烟草Actin为内参基因，反转录合成cDNA模板，对多重PCR扩增反应的反应产物进行荧光检测，采用2^–ΔΔCT法分析实验结果，得到接种前后抗性接种植株的SoCYP85A1基因的表达量。