[发明专利]一种提高马尾松体胚诱导率的方法

说明书

本发明提供一种提高马尾松体胚诱导率的方法，包括外植体预处理、外植体消毒和体胚诱导工序，采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，对外植体进行预处理和消毒处理后，无菌剥取外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3‑4周，最后获得生长迅速、活力旺盛的马尾松胚性细胞系。本发明经过系列优化的外植体处理与消毒，再剥取球果中的雌配子体进行诱导，形成了大量活力旺盛的胚性细胞系，为进一步开展马尾松体胚育苗、种质创新与生物工程育种奠定了有力的物质资源与技术保障，具有较好经济效益、社会效益和生态效益。

技术领域

本发明属植物繁殖技术领域，涉及组织培养体胚发生技术，尤其是一种提高马尾松体胚诱导率的方法。

背景技术

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国南方生态建设和造林用材的主要树种。作为一种综合利用价值高、推广前景广阔的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤工业制造，还可用来生产松香、松节油等工业原料。广西作为一个林业大省，根据自治区“十三五”林业发展规划，松脂产业、木材产业等千亿元特色优势产业的发展在广西林业经济建设中占有举足轻重的地位，大力发展马尾松产业意义重大。自六五国家科技攻关以来，我国在马尾松良种选育和速生丰产栽培技术等方面取得了较大突破。由于气候和地理环境等自然条件的优势，在马尾松种质资源收集、保存及良种选育方面，广西在国内处于领先地位。桐棉松是马尾松的一种，产于广西宁明县桐棉乡。1984年经全国南方14个省（区）的林业专家综合评估，审（认）定为国家级马尾松优良地理种源。作为广西特色优势性树种，桐棉松生长性状佳、产脂力高、材质优良、适应性强，在我国广西、广东、福建、四川、浙江等南方省（区）均有广泛引种栽培。

马尾松育种周期长，加之近年来随着种子园母树老化，结实量下降，良种匮乏，导致南方马尾松人工林遗传分化差异大、林分质量不高、生产力低下。为推动马尾松产业高效发展，实现优良品系无性育苗的良种产业化尤为关键。植物组培技术的使用，是实现良种育苗产业化的有效途径。在组培技术中相对于器官发生而言，体细胞胚胎发生作为植物细胞全能性的一种表达方式，是植物细胞工程中植株再生的重要手段，其具有繁殖效率高，结构完整、遗传稳定及不受自然条件限制等诸多优势，在大规模无性繁殖、人工种子制备、种质保存及遗传转化等诸多领域均具有重大应用价值，是当前国际上进行林木无性快繁的主要手段。目前，马尾松体细胞胚胎发生已有相关研究，但尚存在胚性愈伤组织诱导率低、分化困难、萌发率低、难以获得再生植株等问题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种以马尾松优良种质资源桐棉松优树为繁殖材料，胚性愈伤质量好，易形成胚性细胞系的提高马尾松体胚诱导率的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种提高马尾松体胚诱导率的方法，包括外植体预处理、外植体消毒和体胚诱导工序，采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，对外植体进行预处理和消毒处理后，无菌剥取外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3-4周，最后获得生长迅速、活力旺盛的马尾松胚性细胞系；主要操作步骤如下：

（1）外植体预处理：

采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，用体积浓度45%酒精+体积浓度0.03%链霉素+100 mg·L^-1烟酸混合液进行外植体表面擦拭消毒后，将外植体装置塑料自封袋中，并置于5-8℃冰箱中存放10-14 d；

（2）外植体消毒：