[发明专利]一种提高马尾松体胚诱导率的方法

权利要求书

1.一种提高桐棉松体胚诱导率的方法，其特征在于：包括外植体预处理、外植体消毒和体胚诱导工序，采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的桐棉松未成熟球果作为外植体，对外植体进行预处理和消毒处理后，无菌剥取外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3-4周，最后获得生长迅速、活力旺盛的桐棉松胚性细胞系；主要操作步骤如下：

（1）外植体预处理：

采集健康、无病虫害、合子胚处于裂生多胚期的马尾松优树未成熟球果作为外植体，用体积浓度45%酒精+体积浓度0.03%链霉素+100 mg·L^-1烟酸混合液进行外植体表面擦拭消毒后，将外植体装置塑料自封袋中，并置于5-8℃冰箱中存放10-14 d；

所述的马尾松优树为桐棉松；

（2）外植体消毒：

将预处理后的外植体取出经流水冲洗2 h后，置于体积浓度为0.1-0.3 %的广谱杀菌剂中浸泡1-2 h，取出外植体将其置于体积浓度为60 %酒精中浸泡3-5 min，再移入体积浓度为8-10 %的次氯酸钠溶液中浸泡2-3 min，取出放于体积浓度为8 %双氧水+体积浓度0.2%吐温20+300 mg·L^-1抗坏血酸的混合液中搅拌浸泡30-40 min后，最后用无菌水冲洗4次，每次冲洗3-5 min；

（3）体胚诱导：

在超净工作台上，无菌剥取经步骤（2）处理后外植体球果中的雌配子体，将其平放于诱导培养基中并置于适宜的环境中培养，胚性愈伤诱导培养周期为：3-4周，获得生长迅速、活力旺盛的桐棉松胚性细胞系；所述的诱导培养基为：改良DCR培养基 + 2,4-D 0.5 mg·L^-1 + NAA 5.0-9.0 mg·L^-1 + 油菜素类酯 1.0-2.0 mg·L^-1+ ABA 0.5-1.0 mg·L^-1 + 多效唑0.66 mg·L^-1+ 硝酸银 0.5-1.0 mg·L^-1 +谷氨酰胺 2000 mg·L^-1 + 酸水解酪蛋白1000mg·L^-1 + 葡萄糖20000 mg·L^-1 + 果糖10000 mg·L^-1 + 乳糖10000 mg·L^-1 + 琼脂4500mg·L^-1 + 活性炭 3000-5000mg·L^-1 + 250 mg·L^-1 MES；

所述的改良DCR培养基的组成为：KNO₃ 570 mg·L^-1；NH₄NO₃ 120 mg·L^-1；KH₂PO₄ 240mg·L^-1；CaCl₂·2H₂O 75 mg·L^-1；Ca(NO₃)₂·4H₂O 100 mg·L^-1；MgSO₄·7H₂O 650 mg·L^-1；柠檬酸亚铁 96.5 mg·L^-1；Na₂EDTA 40.0 mg·L^-1；MnSO₄·H₂O 30.0 mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O43.0 mg·L^-1；CuSO₄·5H₂O 0.25 mg·L^-1；H₃BO₃ 31.0 mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg·L^-1；KI 4.15 mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O 0.25 mg·L^-1；维生素B₁ 1.0 mg·L^-1；维生素B₆ 0.5mg·L^-1；烟酸 0.5 mg·L^-1；甘氨酸 2.0 mg·L^-1；维生素E 0.5 mg·L^-1；维生素B₁₂ 0.5mg·L^-1；生物素 0.5 mg·L^-1；肌醇 10000 mg·L^-1。