[发明专利]一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法

说明书

本发明公开的一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养。本发明的优点在于，能够快速、高效获得紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率达到44.22个/蕾，进而获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种。

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体为一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法。

背景技术

单倍体育种具有巨大的商业应用价值，利用单倍体诱导产生单倍体植株，进而自然或人工加倍，即可在两年内获得纯合的育种材料，可以显著加快选择进程，缩短育种周期。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)属多年生异花授粉植物，其群体的遗传组成复杂多样，基因型长期处于杂合状态，植株自交不亲和，因此紫花苜蓿主要采用混合选择、综合品种育种、轮回选择等方法选育新品种。但是利用上述方法至少需要6-7年的时间才能选育出一个优良的群体，且极难得到纯合的材料，育种周期长、难度大、效率低，单倍体育种则是紫花苜蓿育种途径的理想选择之一，只需要经过两个世代就可以选育出基因型完全纯合的材料，简化了育种流程，提高了育种效率。

目前植物游离小孢子培养技术已成为获得单倍体植株的最重要手段之一。现已在250多个物种上进行了小孢子培养技术的研究，紫花苜蓿采用游离小孢子培养后出胚率较低，且未有获得单倍体植株的报道。因此，急需通过优化一些影响植物小孢子出胚率的因素，提高紫花苜蓿小孢子的出胚率，并进而获得单倍体植株，对加快小孢子培养技术在紫花苜蓿育种中的应用具有重要的理论意义和实用价值。

发明内容

为解决现有技术中紫花苜蓿采用游离小孢子培养后出胚率较低的技术问题，本发明提供了一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，实现的目的为能够快速、高效获得紫花苜蓿的小孢子胚，出胚率达到44.22个/蕾，进而获得的再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为，本发明提供了一种提高紫花苜蓿游离小孢子出胚率的方法，该方法包括在紫花苜蓿盛花期，从供体植株上挑选健壮无病虫害花蕾，选取游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养。本发明选择游离小孢子处于单核居中期的花蕾进行培养，是由于单核居中期的游离小孢子出胚率最高，显著高于小孢子其他的时期出胚率。

进一步的，在对所述花蕾进行培养前，对所述花蕾先用75％酒精消毒30s，之后用8％次氯酸钠消毒12min，无菌水冲洗5次后放于无菌研钵中，采用无菌操作能够有效防止小孢子被污染。

进一步的，所述培养方法包括在无菌研钵中加入半量MS液体培养基与B5液体培养基，MS液体培养基与B5液体培养基的体积比为1:1，用研棒轻轻挤压使小孢子游离于所述混合培养基溶液中，用400目孔径尼龙网纱过滤收集滤液，离心3次，每次3min，然后将滤液悬浮于半量MS液体培养基与半量NLN液体培养基所组成的混合培养基中，MS液体培养基与NLN液体培养基的体积比为1:1，调整小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中密度至1×10⁴个/mL。

进一步的，所述小孢子在MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中培养时，将接种有小孢子的MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基分装于无菌、直径为60mm的培养皿中，每皿2mL。将小孢子分装培养可提供更为舒适的空间。

进一步的，所述培养方法包括向MS液体培养与NLN液体培养基所组成的混合培养基中添加100μL质量浓度为2％的活性炭，封口，4℃低温暗培养24h后，转到35℃高温暗培养72h，再转到25℃暗培养直至出胚。选择的具体温度条件有利于提高小孢子出胚率。所添加的活性炭可为小孢子的发育提供暗环境；吸附离体培养中的抑制性物质；对离体培养有益物质解吸附。

进一步的，在游离小孢子出胚3周后，将胚转至B5固体培养基中，在25℃、光照16h/d条件下培养成再生植株。通过本发明方法提高游离小孢子出胚率，还可以利用继续培养的再生植株可用于紫花苜蓿单倍体育种。