[发明专利]一种耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法

说明书

本发明公开了一种利用NaCl驯化产透明质酸菌种耐高盐性并利用该菌株生产透明质酸的方法，利用产透明质酸的菌株通过发酵的方式生产透明质酸，奇特地在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液，解决发酵液黏度过大，传质效果变慢，发酵能力下降的问题；并通过扩大培养基中加入高浓度的NaCl对兽疫链球菌进行驯化处理，将驯化菌株经过逐级扩大培养，避免了在发酵过程中添加高浓度的NaCl溶液对菌体的损伤问题，从而提高了透明质酸的含量。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，更具体地涉及一种耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法。

背景技术

透明质酸（Hyaluronic acid，简称HA），又名玻璃酸，是一种广泛存在于结缔组织及某些微生物荚膜中，具有特殊功能的胞外大分子酸性粘多糖 。1934年由美国 Meyer 等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质。其分子结构是由 D-葡萄糖醛酸(glucuronic acid)和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)通过β-1,4 和β-1,3 糖苷键反复交替连接而成，分子量在1.0×10⁵-4.0×10⁶ Da 之间。我国从80年代开始研究透明质酸的分离纯化制备工艺和临床应用，90 年代初已有透明质酸制剂作为新药上市，生产方法由提取法发展到微生物发酵法。

透明质酸是国际上公认的最好的保湿剂，因为透明质酸具有保湿、营养、润肤等作用，故其广泛地用于各种高级化妆品中，与传统的保湿剂相比，透明质酸具有更高的保湿效果，且无油腻和阻塞皮肤等缺点。当透明质酸加入化妆品中涂于皮肤表面时，会形成一层粘弹性透明水化膜，这层膜具有很好的保水作用，就像天然存在于细胞间质中的透明质酸一样，能增加皮肤角质层的水分，而角质层的水分与维持皮肤健康和外界刺激的防御机能密切相关。

目前国内发酵法生产透明质酸，所用菌种为兽疫链球菌，在发酵后期因发酵粘度加大，流加液碱与发酵液混合传质变慢，菌体生长所需合适环境（pH值）被打破，菌体受损，发酵能力下降，培养基利用不充分，发酵粘度和HA含量都普遍偏低，从而限制了透明质酸在化妆品以及医药用品的应用。

专利号为201210520968.8的国家发明专利公开了一种发酵生产透明质酸的方法，利用了马腺疫链球菌兽疫亚型的一种菌种采用是生物发酵的方法，经过平板、斜面、种子罐到发酵罐的过程，并添加了青霉素，最终产生了含有透明质酸的发酵液，其中透明质酸的量最高为0.645mg/L，产量提高10%~30% ；平均分子量为1000kDa，但是该方法生产的透明质酸含量较低，这可能与后期因为透明质酸含量增加，发酵液黏度提高，发酵液溶氧效果下降，导致菌体活性降低的问题导致的。

专利号为201711052093.2的国家发明专利公开了一种透明质酸的生物发酵生产工艺，利用了兽疫链球菌，通过菌种活化、种子液制备、扩大培养和发酵培养，并通过后期加大搅拌，提高溶氧的方法解决发酵后期因为透明质酸含量增加，发酵液黏度提高，发酵液溶氧效果下降，导致菌体活性降低的问题，该方法相对于专利号为201210520968.8的方法生产的透明质酸的含量有了明显的提高，最高能够达到10.4g/L。但是，透明质酸的转化率和产量还是存在不高的问题。

发明内容

为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种利用NaCl驯化产透明质酸菌种耐高盐性并利用该菌株生产透明质酸的方法，能够有效的解决发酵过程中发酵液黏度过大，传质效果变慢，菌体受损，发酵能力下降的问题。

本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：耐高渗菌的驯化及提高透明质酸产量的生产方法，包括耐高渗菌的驯化方法和透明质酸的生产方法；其特征在于所述耐高渗菌的驯化方法包括在培养基中加入NaCl对菌种进行驯化处理，所述透明质酸的生产方法包括将所述驯化菌种接种到种子罐培养，最后将种子罐的菌种转种到发酵罐培养，经过发酵培养并获得含有透明质酸的发酵液。

进一步地，所述耐高渗菌的驯化方法的操作步骤为：