[发明专利]一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法

说明书

一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法：在第0～1天对传代培养至4～5代的多能干细胞进行诱导分化，使用的培养基中含有2～15μM的GSK‑3抑制剂；在第2～3天使用含有0.2～5μM视黄酸的培养基继续诱导分化；在第4～5天使用含有2～10μM的Wnt抑制剂的培养基诱导分化；以后利用培养基对细胞进行诱导分化，在第9～10天能观察到心肌细胞的跳动；其中，在第1～6天，使用第一诱导分化培养基，其包括RPMI‑1640基础培养基、B27‑insulin；在第7天以后，使用第二诱导分化培养基，其包括RPMI‑1640基础培养基以及B27；或者在整个诱导分化培养过程中，使用CDM3诱导分化培养基或无血清的诱导分化培养基，其中CDM3诱导分化培养基包括RPMI‑1640基础培养基、血清白蛋白、抗坏血酸和双抗。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法。

背景技术

心脏疾病在国内外的发病率和死亡率已居于首位，成为严重危害人类健康的疾病之一。大多数病人由于缺血性或其他病理性损伤从而导致心肌受损，出现心脏功能不足，严重威胁生命。干细胞具有高度自我更新、增殖和多向分化潜能、可植入性及具备重建能力等特征，在再生医学领域具有不可估量的医学价值和诱人的应用前景。这些年，随着干细胞技术的深入发展，利用干细胞分化的心肌细胞为损伤心肌修复和替代治疗提供了可能。胚胎发育过程为干细胞定向分化提供了重要线索，在过去的几年中，通过操控心脏发育关键通路，在心肌定向分化方面取得了重要进展，但是现有的诱导心肌细胞的分化方法仍不成熟，表现为可重复性差、分化效率不稳定等。

目前，关于心肌细胞的分化技术已经有许多种方法，由于所用专有培养基的复杂性，体外心脏分化的相对自主性，所以人们对于体外心脏分化所需的途径和大分子知之甚少。2012年，Lian XJ通过调节经典Wnt通路的开启和关闭实现了心肌细胞的定向分化，之后，基于这一原理实现了在成分明确的培养基中进行心肌细胞的定向分化，为心肌细胞的临床应用奠定了基础。2014年，Paul指出过去的诱导方法中所用专有培养基成分复杂，所以提出利用化学成分确定的诱导培养基，通过添加CHIR99021等小分子化合物，获得相对较高的心肌细胞。

目前，关于心肌细胞的分化技术的缺点主要有以下几个方面：(1)现有的分化方法仍不成熟，表现为可重复性差、分化效率不稳定；(2)分化方法复杂，所需成本较高；(3)分化的心肌细胞纯度低、安全性较低、均一性差；(4)诱导的心肌细胞移植到动物体内，存在心率失常、致瘤性和重塑心脏结构差等问题。

视黄酸(RA，retinoic acid，all-trans-RA)是来源于视黄醇(Retinol，又称维生素A，Vitamin A)的形态发生素，在细胞生长、分化和器官发生过程中发挥重要作用。过去研究的是视黄酸(RA)通路在心脏发育过程中发挥重要作用，RA缺失会导致心房变小、心室小梁减少、心肌壁增厚且细胞间连接松散。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法，本发明的方法简单、稳定高效，大大提高了多能干细胞向心肌细胞的分化效率。

本发明提供了一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法，包括以下步骤：

(1)在第0～1天对传代培养至4～5代的多能干细胞进行诱导分化，所使用的培养基中含有2～15μM的GSK-3抑制剂；

(2)在第2～3天使用含有0.2～5μM视黄酸的培养基继续进行诱导分化；

(3)在第4～5天使用含有2～10μM的Wnt抑制剂的培养基继续进行诱导分化；

(4)第7天以后利用培养基对细胞进行诱导分化，第9～10天能观察到心肌细胞的跳动；其中，