[发明专利]一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的诱导方法

权利要求书

1.一种提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法，所述多能干细胞为胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在第0～1天对传代培养至4～5代的多能干细胞进行诱导分化，所使用的培养基中含有2～15μM的GSK-3抑制剂；所述GSK-3抑制剂为CHIR99021；

(2)在第2～3天使用含有1μM视黄酸的培养基进行诱导分化；

(3)在第4～5天使用含有2～10μM的Wnt抑制剂的培养基继续进行诱导分化；所述Wnt抑制剂为IWR-1；

(4)在第7天以后利用培养基对细胞进行诱导分化，第9～10天能观察到心肌细胞的跳动；其中，

在第1～6天，使用的培养基为第一诱导分化培养基，所述第一诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基、不含胰岛素的细胞培养添加剂B27；在第7天以后，使用的培养基为第二诱导分化培养基，所述第二诱导分化培养基包括RPMI-1640基础培养基以及含胰岛素的细胞培养添加剂B27。

2.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法，其特征在于：在步骤(1)之前，还包括使用mTeSR1或E8培养基培养所述多能干细胞的步骤，当细胞密度达到80～85％时，对细胞进行传代培养。

3.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法，其特征在于：在步骤(1)中，还包括将传代培养至4～5代的多能干细胞以10⁴/cm²的密度接种至培养皿中，然后培养至细胞密度达85％以上时，再进行诱导分化的步骤。

4.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法，其特征在于：所述第一诱导分化培养基中不含胰岛素的细胞培养添加剂B27的质量分数为2％。

5.根据权利要求1所述的提高多能干细胞定向分化为心肌细胞的分化效率的方法，其特征在于：所述第二诱导分化培养基中含胰岛素的细胞培养添加剂B27的质量分数为2％。