[发明专利]一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体

说明书

本发明公开了一种催化效率提高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明提供的一种Dorea sp.DPEase的突变体酶A38E/G105A，其最适催化条件没有发生改变，在最适催化条件下，酶催化底物D‑果糖生成D‑阿洛酮糖的相对酶活则提高了38.6％，这一发现对于工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

近年来我国营养保健品行业发展迅速，增长速度可保持12％至15％，目前已超过日本成为保健品第二大市场。随着我国经济的持续发展，人们的饮食结构也将发生重大变化，逐渐向更安全、更合理、更健康的方向发展。当前，由过度摄入高糖食品导致的慢性病急剧增长，例如肥胖症、糖尿病、高血压和高血脂等。因此，低能量的稀有糖逐渐引起了国际社会的普遍关注。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是一种天然的稀有单糖，在自然界中的存在量极少。D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％。但能量值却极低，因此是一种理想的甜味剂和蔗糖替代品。此外，D-阿洛酮糖还有独特的生理功能和潜在的保健功能，受到了广泛的关注，包括减少脂肪堆积、降低餐后血糖水平、抑制肝脂肪酶活性、清除活性氧簇、治疗动脉粥样硬化疾病、增强胰岛素抗性和保护神经等。D-阿洛酮糖的吸收率远低于其他甜味剂，特别是D-葡萄糖。此外，通过竞争吸收和排泄转运糖蛋白，D-阿洛酮糖还可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收。通过竞争性抑制，D-阿洛酮糖可以减少D-果糖和D-葡萄糖的摄入量，进而增强胰岛素抵抗性，减少体内脂肪积累和降低潜在的糖尿病风险等作用。D-阿洛酮糖还具有其他一些生理功能：通过抑制促炎细胞因子活性，起到抗炎作用；提高细胞内谷胱甘肽水平，达到神经保护作用。

在D-阿洛酮糖的生物转化中，酮糖3-差向异构酶起着不可或缺的作用。近年来，研究学者多关注酮糖3-差向异构酶的催化过程调控及稀有糖生物转化。基于基因工程和蛋白质工程的分子改造技术已广泛应用于L-阿拉伯糖异构酶和D-葡萄糖异构酶的研究当中，并已经获得了一些性能优良的突变体。然而，关于酮糖3-差向异构酶的分子改造的研究还很少。

发明内容

本发明的目的是为了获得更适合的生物催化剂。本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Dorea sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行分子改造，以进一步提高其催化活性以得到更适合于工业应用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，对D-阿洛酮糖的合成具有重要的现实意义。

本发明首先提供了一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A，是将来源于微生物Dorea sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变得到的单突变体酶；即将原来Dorea sp.DPEase酶中的A38位的丙氨酸Ala替换成谷氨酸Glu，G105位的甘氨酸Gly替换为丙氨酸Ala，获得双点突变体酶，命名为A38E/G105A。

与野生酶Dorea sp.DPEase相比，所述Dorea sp.DPEase的突变体酶A38E/G105A的最适催化条件没有发生改变，但在最适催化条件下，酶催化底物D-果糖生成D-阿洛酮糖的相对酶活则提高了38.6％。因此，突变体酶A38E/G105A对于工业化制备D-阿洛酮糖具有重要的价值。

编码所述野生酶Dorea sp.DPEase基因见序列表中SEQ ID No:1，编码289个氨基酸，见序列表中SEQ ID No:2。

编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A的基因序列见序列表中SEQ ID No:3，A38E/G105A的氨基酸序列见SEQ ID No:4。

本发明还提供一种携带编码所述突变体酶A38E/G105A的基因的重组表达质粒pET-22b(+)-A38E/G105A。