[发明专利]一种酶活提高的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种酶活提高的L‑天冬氨酸β‑脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程领域。本发明的突变体是在SEQIDN0.2所示的氨基酸的基础上，将第484位亮氨酸突变成甲硫氨酸。因为表达包涵体问题将构建的重组载体L484M‑pET28aN端起始密码子后一段冗余序列删除得到重组质粒L484M‑pET28a‑M。本发明得到的突变体在大肠杆菌中表达，经纯化得到的酶做酶学性质研究，pH4.5、pH5.0、pH6.5下相对酶活分别提高了40％、36％、42％。L484M和未突变酶在相同酶活不同pH条件下进行全细胞转化1h取样测定产量，在最适pH5.5条件下，产量提高48.5％。本发明表明484位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-丙氨酸是一种非必需氨基酸。随着对L-丙氨酸不断研究和开发，在食品、医药、化学合成等行业的应用不断扩大。L-丙氨酸是存在于许多食品中的一种氨基酸，已经用作饮食的添加剂，如防腐剂，风味调味料，氨基酸低度酒和饮料等。在医药上的应用，通过水解蛋白制成氨基酸输液，L-丙氨酸在治疗如肝病引起的蛋白质合成紊乱、糖尿病、急慢性肾功能衰竭以及对维持危急病人的营养、抢救患者的生命方面起到了积极作用；L-丙氨酸可以有效地减轻酒精对肝脏的损害；L-丙氨酸还是血液保存剂的主要成分等。在化学合成中的应用，如合成抗癌物4-羟基水杨醛丙氨酸合锌，合成VB5等。

L-丙氨酸制备经历了由蛋白水解提取法、发酵法到酶法(固定化细胞法或游离整体细胞法)的过程。现在工业化生产的方法就是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的微生物(如Pseudomonas dacunhae等)细胞催化L-天冬氨酸而得到的，而L-天冬氨酸则可通过固定化Escherichia Coli高效地催化富马酸铵而制得。其中日本多采用固定化细胞法，而我国均采用游离整体细胞法。

固定化法是将P.dacunhae用卡拉胶固定化与固定化大肠杆菌分别装柱串联，从而达到从富马酸铵到L-丙氨酸的连续化生产。M.Furui等人用密封的加压反应器，使CO₂溶于混和液中，保证了平推流特性和防止细胞流失，很好的解决了天冬氨酸脱羧反应过程中的CO₂释放从而破坏固定化细胞，导致细胞流失和流体出现返混现象问题，为了防止L-天冬氨酸-β-脱羧酶活力的固定化失活、pH调整失活和抑制丙氨酸消旋酶活力，在固定化前将整体细胞用醋酸、PLP溶液(pH 4.75)和戊二醛进行处理。

游离整体细胞法是将P.dacunhae发酵培养，以培养液作为酶源，直接添加固体L-天冬氨酸实现酶法转化。Goto.Markoto将P.dacunhae细胞用EDTA等表面活性剂处理来提高酶的活力；而抑制消旋酶可以通过调整酶催化反应的pH值进行，一般pH控制在4.5～5.5之间。游离整体细胞法的关键技术是如何提高酶活力和酶的稳定性、防止消旋酶的产生。Goto.Markoto的方法较好的解决了这些问题。

综上所述，目前L-天冬氨酸β-脱羧酶催化合成L-丙氨酸缺陷，酶反应pH范围较窄，会导致pH调整失活，对过程控制要求较为严格等问题。本发明旨在对L-天冬氨酸β-脱羧酶进行突变，扩宽其pH作用范围，降低酶催化操作难度，提高其工业应用价值和生产效率。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种酶活提高L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将484位氨基酸由亮氨酸突变成甲硫氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。