[发明专利]一种提高印度梨形孢液体发酵产物产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种提高印度梨形孢液体发酵产物产量的方法。

背景技术

印度梨形孢(Piriformospora indica)是印度Ajit Verma等人1998年在印度西北部的塔尔沙漠的灌木的根际土壤中分离孢子时得到的，是一种能进行纯培养的类菌根真菌。属担子菌门Basidiomycota，层菌纲Hymenomycetes，具有典型的梨形厚垣孢子。

研究表明，不仅印度梨形孢的菌丝体与孢子对植物的生长具有促进作用，其代谢物对植物也具有促进作用，使其具有广泛的应用前景。

印度梨形孢在传统的Kafer培养基上长速较慢，为了促进印度梨形孢的液体培养产量，提高代谢物的作用，发明提高印度梨形孢液体发酵菌丝体产量的方法将具有广泛的应用前景。

冷激蛋白(cold shock domain proteins，CSPs)是广泛存在于生物体中的一种应激蛋白。冷激蛋白在细菌、植物与动物中均有发现，是一类高度保守的核酸结合蛋白，其通过RNA分子伴侣活性参与转录、翻译、生长发育及逆境胁迫应答等细胞生理活动(Chaikam V,Karlson DT(2010),Comparison of structure,function and regulation of plant cold shock domain proteins to bacterial and animal cold shock domain proteins.BMB Rep,43(1):1-8.)。冷激蛋白的其它用途还暂未见报道，有待进行一些应用性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高印度梨形孢液体发酵产物产量的方法，该方法操作简单，绿色环保，为得到高得率的菌丝体产物提供了新的途径。

本发明发现冷激蛋白有利于印度梨形孢发酵代谢产物的生成。在特定的发酵阶段添加冷激蛋白，能有效增加印度梨形孢发酵产物。

本发明采用的技术方案是：

一种提高印度梨形孢液体发酵产物产量的方法，包括步骤：

(1)印度梨形孢液体种子液的制备：将活化后的印度梨形孢菌种接种于液体种子培养基中培养，得到印度梨形孢液体种子液；

(2)固体发酵培养：将步骤(1)中印度梨形孢液体种子液按占固体培养基体积5％-15％的用量接入添加有外源物的固体培养基中，在18℃-28℃培养1天-15天后，将培养产物真空冷冻干燥、粉碎后得外源物固体发酵培养物；所述外源物选用生地、栀子中的一种或者两种；

(3)液体发酵培养：将步骤(1)中印度梨形孢液体种子液按占液体发酵培养基体积3％-12％的量接种于添加有外源物固体发酵培养物的液体发酵培养基中，在18℃-28℃下培养1天-5天后，加入冷激蛋白，将温度调整为15℃-25℃，然后继续培养1天-12天，终止发酵后，得到印度梨形孢发酵产物。

所述的印度梨形孢菌种可采用任意一种印度梨形孢菌种，可采用市售产品。例如印度梨形孢(Piriformospora indica)ACCC32574菌种，来源于中国农业微生物菌种保藏管理中心。

为了达到更好的发明效果，进行以下优选：

步骤(1)中，所述活化后的印度梨形孢菌种在液体种子培养基中培养的温度为自然环境温度，优选为22℃-26℃。一般1L液体种子培养基中接入1cm²-3cm²大小活化后的印度梨形孢菌种菌块。

所述活化后的印度梨形孢菌种接种于液体种子培养基中培养的时间一般为1天-9天，得到印度梨形孢液体种子液。

印度梨形孢菌种的活化方法为本领域常规的菌种活化方法，一般包括：将斜面保藏的印度梨形孢菌种接种到PDA平板培养基上，在22℃-28℃活化培养4天-15天，得到活化后的印度梨形孢菌种。

所述PDA平板培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA平板培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000mL。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖5g-20g、酵母粉4g、蛋白胨3g、KH₂PO₄1g和MgSO₄ 0.5g，用水定容至1000mL。

步骤(2)中，所述添加有外源物的固体培养基由外源物加入固体培养基中得到，每升固体培养基中外源物的添加量为1g-18g。