[发明专利]一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法

说明书

本发明公开了一种酶活提高的L‑天冬氨酸α‑脱羧酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明的突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第56位谷氨酸突变成丝氨酸。本发明得到的突变体在大肠杆菌中表达，经过对纯酶的酶活测定，突变酶E56S的酶活相对原始酶BsADC提高了55％，并且用水作为溶剂进行的产β丙氨酸实验，可以实现8h产215gβ丙氨酸，且其转化率为94％。本发明表明56位氨基酸残基对酶的催化作用有较大影响，对该酶的催化机理的研究提供了一定的基础，并提高了该酶的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及一种酶活提高的L-天冬氨酸α-脱羧酶变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-天冬氨酸α-脱羧酶(L-aspartateα-decarboxylase，E.C.4.1.1.1)能够将L-天冬氨酸在α位脱羧形成β-丙氨酸和气体二氧化碳，β-丙氨酸在医药和保健品上都要很重要的应用，在医药上β-丙氨酸可用合于成作泛酸钙、肌肽、怕米磷酸钠和巴柳氮等医用药品，他们在神经修复、缓解肿瘤性骨痛和治疗肠道性等疾病时有较好的效果，在食品添加剂方面，β-丙氨酸主要用于提高人体机能，实现肌肉的发育方面等，是运动员常使用的一种保健品。L-天冬氨酸α-脱羧酶主要在细菌中存在，在植物和部分动物中也有发现，但由于微生物来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶具有蛋白小，易于表达等优点，被广泛研究和用于生产β-丙氨酸。

异源表达L-天冬氨酸α-脱羧酶的问题是个别来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶不能自我成熟需要相关蛋白的协助，这增加的酶应用的难度；并且L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活相对比较低，这些都限制了L-天冬氨酸α-脱羧酶生产β丙氨酸在工业中的应用。因此，选取一种可以自我成熟和高酶活的L-天冬氨酸α-脱羧酶是实现大规模工业化应用的关键，在可以自我成熟的枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶的基础上，进行定点突变提高L-天冬氨酸α-脱羧酶的酶活和热稳定，对于扩大L-天冬氨酸α-脱羧酶产β丙氨酸工业化应用前景具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种酶活提高L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在氨基酸如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将56位氨基酸由谷氨酸突变成丝氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供所述基因的重组表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌的制备方法，所述方法是在SEQ IDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第56位的谷氨酸的密码子突变成了编码丝氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌中即得到基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体是pET28a。

在本发明的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：

(1)以SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为模板，以Fprimer(序列如SEQ ID NO.5所示)，Rprimer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQ ID NO.3所示的重组基因。

(2)将步骤(1)得到的重组基因序列，连接到pET28a表达载体中，得到重组质粒pET28a-E56S，重组质粒化转化E.coli，获得重组大肠杆菌工程菌株，命名为E.coli/pET28a-E56S。