[发明专利]提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近50年来许多国家报道的肺癌的发病率和死亡率均明显增高趋势。由于肺癌的病因至今尚不完全明确以及前期诊断手段的缺失，大多数患者往往不能得益于临床治疗。比如，临床上最常用的化学治疗对非小细胞肺癌也仅有30％-40％的疾病缓解率，且一般不能治愈非小细胞肺癌，只能延长患者生存而且对患者的生活质量有很大影响。

大量研究表明，EGFR基因是肺癌的重要基因靶点，TK类药物吉非替尼和厄洛替尼等分子药物对肺癌有很好的疗效，而吉非替尼和厄洛替尼的疗效与EGFR基因突变状况密切相关。然而，临床上TK类药物并不是对所有的患者有效，因此在临床用药选择时，EGFR基因的诊断特别是占总突变比例较大的外显子19突变的检测就显得尤为重要。

现在，检测肺癌基因突变的方法最主要是DNA测序法，需要获取肿瘤组织、分离肿瘤细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长，费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。另还有毛细管电泳法，聚合酶链式反应-单链构象多态性分析等方法，但它们不仅操作繁琐，而且需要专门的仪器。用于EGFR基因19外显子突变检测的样本主要包括肿瘤组织样本和血液样本，其中组织样本成份复杂，除了肿瘤组织DNA，也含有部分正常组织DNA，加上肿瘤本生的异质性，其待检测突变在样本中所占的比例往往低于20％(测序要求的最低浓度)。血液样本肿瘤组织DNA含量更少，检测困难。

发明内容

本发明的目的是：提供一种提高EGFR基因19外显子缺失突变检测特异性的方法及应用，通过采用改进型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探针法相结合的方法，大大增加了19外显子检测的特异性。

本发明的技术方案是：

本发明的检测特异性的方法是：特异性扩增EGFR基因19缺失突变位点区域的前引物和后引物，所述的前引物末端与野生型不匹配而与突变型匹配，特别的与常规的ARMS引物相比，本引物末端多出2个错配位点，并在第4位人为的再引入一个错配，大大提高了其特异性，有效的防止野生型对检测的影响。该特异性前引物和后引物一起扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50-200bp；特异性针对扩增产物的taqman探针，其Tm高于引物9-12℃，所述的探针携带能检测的荧光标记。

所述的前引物为ARMS引物，与突变基因存在一个碱基的不同其余完全互补，与野生型存在3-4个碱基不同(常规仅有1个不同)，其余完全互补，长度为17-25bp；较佳地为18-22bp。

经过优化得到的探针序列前引物及后引物序列如下：

探针：

FAM-CGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGTG-BHQ1

后引物：

R1：5’-ATGAGAAAAGGTGGGCCTGA-3’

R2：:5’-CTGAGGTTCAGAGCCATG-3’

前引物：2237-2251DEL15 5’-GTCGCTATCAAGGCAGCTC-3’

本发明公开了一种检测人类EGFR基因突变的应用，包括以下步骤:

(1)提供上述引物和探针；

(2)待测样品的处理和模板的提取；

(3)配制荧光定量PCR反应体系；

(4)用步骤(1)的引物和探针扩增待测的突变基因靶序列；

(5)利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过监测反应过程中的荧光强度变化来区分野生型和突变型。

所述的检测人类EGFR基因突变的方法，其中步骤(2)所述的待测样品包括手术切除的新鲜病理组织、甲醛固定石蜡包埋病理组织、石蜡切片、全血、血浆、血清或胸腔积液。

经过优化得到的最佳的反应体系为：

其中所用的酶为TAKALA的rTaq酶，总体系为25ul，在保证各组分浓度不变的情况下，也可调整为20ul，也能取得良好的结果。

经过优化得到的反应程序:

94℃ 3min

94℃ 30s

60℃ 10s

40个循环并且在第三步60℃ 10s结束时收集检测FAM荧光。

本发明的有益效果是：通过采用改进型ARMS引物，建立了ARMS法和taqman探针法相结合的方法，大大增加了19外显子检测的特异性。具有灵敏度高特异性好的特点，适合高通量，微量样本的检测。

附图说明