[发明专利]一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法

说明书

本发明公开了一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及培养方法；所述培养液包括以下组分：毛喉素1～10μmol/L，曲古抑菌素A 50～150 nmol/L，TCM‑199 8～12 g/L，NaHCO₃ 1～4 g/L，D‑葡萄糖0.4～0.7 g/L，丙酮酸钠0.05～0.15 g/L，青霉素钠盐0.05～0.1 g/L，链霉素硫酸盐0.03～0.07 g/L，聚乙烯醇1～4 g/L，促黄体素0.3～0.7μg/mL，促卵泡素0.3～0.7μg/mL，表皮生长因子8～12 ng/mL，L‑半胱氨酸0.3～0.7 mmol/L，卵泡液8～12%；所述培养液可提高猪卵母细胞的卵裂率、囊胚数及囊胚细胞数，有效地提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明属于胚胎工程技术领域，具体地，涉及一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法。

背景技术

哺乳动物卵母细胞体外培养技术（In vitro maturation，IVM）是胚胎工程的重要组成部分，指将卵泡内取出的未成熟卵母细胞经过体外成熟培养，发育至减数第二次分裂中期，可以进行体外受精并分裂成胚胎的技术。猪作为一种常用模式生物，对其卵母细胞体外成熟的研究始于20世纪80年代末，经过多年来的发展，虽已取得了较大的进展，但是体外成熟的猪卵母细胞，其成熟质量和发育潜力与体内相比仍有较大差距。因此，开发提高卵母细胞发育潜力的培养液，完善体外成熟培养体系，仍需要我们的继续努力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中猪卵母细胞体外培养时成熟质量与发育潜力差的缺陷和不足，提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及培养方法，所述培养液可有效地提高体外培养的猪卵母细胞的发育潜力，且制备简单，培养方法简便易行，具有较大的应用前景。

本发明的目的是提供一种猪卵母细胞体外成熟促进剂。

本发明另一目的是提供添加有上述促进剂的猪卵母细胞体外成熟培养液。

本发明的再一目的是提供利用上述培养液提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力的培养方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种猪卵母细胞体外成熟促进剂，所述促进剂由1～10μmol/L毛喉素与50～150nmol/L曲古抑菌素A组成。

本发明的毛喉素（Forskolin）是一种腺苷酸环化酶激活剂，通过刺激腺苷酸环化酶生成大量cAMP，cAMP延迟卵母细胞核成熟，使卵母细胞细胞质得到充分生长，最后达到提高卵母细胞发育潜力的效果，临床多用于抑制肿瘤生长，同时也在辅助生殖领域得到广泛重视。

曲古抑菌素A（TSA）是一种组蛋白乙酰化抑制剂，通过抑制组蛋白的去乙酰化酶，使染色质处于超乙酰化水平，从而达到促进基因转录的作用。目前，TSA多用于核移植时对供体/受体细胞及后期重构胚胎的处理。

研究发现，猪卵母细胞体外成熟存在的一个最大问题就是核质成熟的不统一，本发明选用的两种药品Forskolin和TSA，皆有抑制核成熟的效果，单一高浓度添加虽会对核成熟有一定的延迟效应，但同时也会给卵母细胞造成不可知的影响。本发明通过将毛喉素与曲古抑菌素A分别进行各单一药品、组合药品的多种浓度及添加培养时间尝试后，发现Forskolin和TSA组合用药在一定的浓度及添加时间下具有显著的协同增效，可有效提高卵母细胞的体外发育潜力，大大提升胚胎得率，避免了单一用药带来的缺陷。

本发明的猪卵母细胞体外成熟促进剂可提高猪卵母细胞体外成熟质量与发育潜力，因此，所述促进剂可被添加到猪卵母细胞体外成熟培养液中。