[发明专利]一种提高植物抵御RNA病毒的能力的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物培育技术领域，具体涉及一种提高植物抵御RNA病毒的能力的方法。

背景技术

植物病毒病会对许多植物造成危害，会极大的影响植物的生长，在农业生产中造成严重的损失。根据病毒的基因组构成，又分为RNA病毒和DNA病毒两种。其中植物RNA病毒广泛存在于自然界中，具有非常广泛的宿主。已知的RNA病毒中多数会通过各种途径传播，给经济性作物带来巨大的损失。

以黄瓜花叶病毒为例，它是一种由蚜虫传播的非常严重的植物病毒病害，病毒粒子呈等轴对称的二十面体，基因组为三分子线形正义RNA。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一，可侵染1000多种双子叶和单子叶植物，呈世界性分布，尤其是在温带地区。

传统的在植物中抵御病毒的方式主要针对于抑制病毒的复制、组装或干扰其致病相关蛋白的表达。当病毒在侵染宿主细胞后，病毒会表达复制相关的蛋白，该蛋白会与病毒基因组结合并起始病毒的复制，同时病毒也会表达外壳蛋白，将复制后的病毒基因组进行组装形成新生成的病毒粒子。因此，通过转入全长或部分外源复制蛋白或外壳蛋白，使植物生成针对这些病毒蛋白的小干扰RNA，从而抑制病毒的复制和组装。然而，高表达量、干扰宿主细胞生长、非普适性、抗性丢失等问题使得该技术具有巨大的劣势。也有报道利用RNAi技术来干扰病毒致病蛋白的表达从而达到抗病毒的目的，但是该技术也因为其同源依赖性、以及病毒具有对抗RNAi抑制子的问题而不具有普适性。

近年来随着基因编辑技术的发展，利用外源人工锌指蛋白系统(Artificial zinc finger proteinAZP)、转录激活因子样效应物核酸酶系统(Transcription activator-like effector nucleases，TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences，CRISPR)开发了多种在植物上的抗病毒技术。尤其是利用细菌中获得的CRISPR系统，靶向性的切割外源病毒的基因组DNA能够产生很高的抗病毒效率。但是，利用这些基因编辑技术的抗病毒体系，都是针对DNA病毒的，目前依然没有发开出有效的基于基因编辑技术的抗RNA病毒体系。

随着对不同细菌来源的CRISPR系统的深入研究和筛选，在一种叫新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)的细菌中，发现其表达的Cas9核酸内切酶(FnCas9)能够靶向RNA，不同于目前在基因编辑领域常用的来自酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的只能靶向DNA的核酸内切酶(SpCas9)。如果能将该针对RNA的CRISPR系统表达于植物中，并靶向侵染植物的RNA病毒，将能够显著提高植物的抗病毒能力。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种提高植物抵御RNA病毒的能力的方法，本发明仅基于病毒的基因组序列，而不需要了解病毒基因的具体功能，所以该方法可以广泛地应用于抵御序列已知的各种RNA病毒。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种提高对RNA病毒抵御能力的植物的培育方法，包括以下步骤：

S1从待抵御的RNA病毒的基因组序列中选取若干靶序列，针对若干所述靶序列，分别设计合成与所述靶序列反向互补的DNA片段，所述DNA片段为双链DNA，所述靶序列的序列排列规则为5’-N_X-C-3’；

其中，N_X表示X个连续的核糖核苷酸，N表示A、G、C、U中的任一种，10≤X≤30，且X为整数；

S2将步骤S1中获得的若干个所述DNA片段分别构建到用于表达CRISPR/Cas9核酸酶的载体中，得到若干个重组载体；

S3将若干个所述重组载体分别导入受体植物，从导入所述重组载体的受体植物中获得对所述RNA病毒抵御能力提高的植物。

优选地，所述重组载体能转录向导RNA和表达FnCas9蛋白，所述向导RNA为由crRNA和tracrRNA通过碱基配对结合而成的具有回文结构的RNA；所述crRNA含有由所述DNA片段转录所得的RNA片段。

优选地，该方法用于提高植物抵御RNA病毒能力，包括以下步骤：

S11获得目的DNA片段：