[发明专利]一种提高Fab抗体表达量的方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程中提高Fab抗体表达量的方法。该方法包括：构建重组质粒pVEGF‑Fab，制备特定的蛋白酶缺陷性细胞突变株（△pepN、△DegQ、△dcp和△pepP），转化，诱导表达Fab抗体等步骤。本申请对于宿主细胞株的改造较为特殊和新颖，所制备宿主细胞株由于特定蛋白酶缺失，可较好解除对Fab表达后抑制或降解作用，从而提高Fab表达量，因而对于特定的Fab抗体表达制备具有较好地应用价值，同时也为其他抗体蛋白表达和制备提供了较好的借鉴和参考，因而具有较好的实用价值和科研意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因工程中提高Fab抗体表达量的方法。

背景技术

细菌细胞(例如大肠杆菌，E.coli)通常用于产生重组蛋白。细菌表达系统相比真核细胞表达系统具有成本低廉、大规模发酵容易、条件易于自动化控制等优点，通过大肠杆菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径。使用细菌细胞(例如大肠杆菌)来产生重组蛋白还有其他许多优势，特别是由于细菌细胞作为宿主细胞的通用性质允许了通过质粒的基因插入。大肠杆菌被用于产生许多重组蛋白，包括人胰岛素和Fab抗体蛋白等。

Fab是IgG分子的抗原结合片段，是由Fd链与L链通过二硫键结合形成的异二聚合体。由于Fab抗体片段没有Fc段，不需要进行复杂的糖基化和翻译后修饰，所以不需要通过哺乳动物细胞系统来生产。而大肠杆菌凭着自身遗传背景清楚、易于操作、生产周期短、成本低且表达量高以及表达产物易于分离纯化等优点，成为大规模制备重组抗体片段最常用的原核表达系统。大肠杆菌周质空间中蛋白酶含量低、杂蛋白含量少，因此Fab在周质空间中的表达更有利于生产制备高活性的Fab抗体。

尽管使用细菌细胞来产生Fab重组蛋白有许多优势，但仍有显著的局限，这包括对蛋白酶敏感性较好地Fab蛋白。其原因在于，Fab在大肠杆菌表达中最具挑战性的问题就是4个链内和1个链间二硫键的形成，这关系到Fab分子结构和功能的完整性。一般而言，蛋白酶对于大肠杆菌周质和胞质中旧的和错误折叠的蛋白的翻换起重要作用。当细菌蛋白酶起作用时，可对重组蛋白进行降解，从而显著降低活性蛋白的产率。在大肠杆菌中，已鉴定获得了许多细菌蛋白酶，包括DegP-Q、Tsp、prlC、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpA、clpP、ClpX、dcp、DegS、lon等等。

对于部分蛋白研究成果列举如下：

氨肽酶N(Aminopeptidase N，pepN)，蛋白分子量为99kDa，属于蛋白家族M1，在其活性中心发现锌离子。氨肽酶N在哺乳动物、昆虫、植物和细菌等多种物种中具有良好的保守性。在大肠杆菌，氨肽酶N被认为是主要的氨肽酶，它依赖ATP降解胞内蛋白。在应对营养缺陷时，氨肽酶N在蛋白降解中发挥主要作用，使降解的氨基酸成为可利用的营养物质。进一步发现，邻菲咯啉，嘌呤霉素，乌苯美司抑制等可抑制该酶活性。

大肠杆菌degQ基因，编码455个氨基酸残基的蛋白质degQ，该蛋白属于丝氨酸内肽酶家族。应激状态下，degQ的主要功能是降解大肠杆菌周质腔内聚集的大量变性和未折叠的蛋白质。degQ可高效打开Val-Xaa和Ile-Xaa间的肽键。

大肠杆菌dcp基因，编码681个氨基酸残基的蛋白质dcp，该蛋白属于C端外肽酶，在其活性中心发现锌离子。dcp酶具有广泛的特异性，可以从蛋白质及各种肽C末端切割二肽。

大肠杆菌pepP基因，编码441个氨基酸残基的蛋白质pepP，该蛋白属于N端外肽酶，在其活性中心发现锰离子。dcp酶可以从蛋白质及各种肽N末端释放任何与脯氨酸相连的氨基酸残基，包括脯氨酸。