[发明专利]一种鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及渔业领域，具体涉及一种鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的方法。

背景技术

鱼类早期资源调查是以鱼类早期生活史阶段为对象进行的资源量调查研究工作，是进行鱼类生态学和渔业生物学研究的一个重要手段。鱼类早期资源调查可以推算鱼类繁殖群体数量，估算补充群体数量，科学地预测鱼类种群数量变动，为渔业资源保护和合理开发利用提供科学依据。在早期资源调查过程中，需要对采集的鱼卵、仔稚鱼进行分类鉴定和数量统计，以往的分类鉴定需要有一定的基础知识和经验积累的工作者进行目测和显微镜观察，工作量大，消耗时间长，而且有些种类鉴定准确性不好把握。在鱼卵、仔稚鱼调查采样数量较大时，以往的分类鉴定方法就表现出明显的不足。

发明内容

本发明的目的是为了克服以往分类鉴定方法的不足，提供一种鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的方法。本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

一种鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的方法，包括以下步骤：

(1)采集调查水域的成鱼样本，并对成鱼样本进行分类鉴定，将已分类鉴定的各种鱼类提取DNA，并对COⅠ序列分别进行PCR扩增测序，据此建立该调查水域鱼类的COⅠ序列数据库；

(2)将调查采集到的鱼卵、仔稚鱼样本编号，用相同方法对鱼卵、仔稚鱼COⅠ序列进行扩增测序；

(3)将鱼卵、仔稚鱼COⅠ序列测序结果与已建立的COⅠ序列数据库进行比对分析，从而鉴定鱼卵、仔稚鱼的种类。

步骤(1)中所述DNA提取方法为：取成鱼新鲜肌肉或鳍条组织，用无水乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20℃保存备用。

所述的COⅠ序列通用扩增引物为：Forward primer：

5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3，Reverse primer：

5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3。

所述的PCR扩增反应体系为：95℃预变性3分钟；每一个循环94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，共30个循环；最后72℃延伸6分钟；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒回收，测序。

本发明在采集鱼卵、仔稚鱼后仅需用无水乙醇保存，不需要复杂的保存条件，同时选用COⅠ序列这一相对保守的片段建立调查水域鱼类COⅠ序列数据库，对鱼卵、仔稚鱼相应片段进行扩增测序，然后与COⅠ序列数据库进行比对分析的方法对调查水域鱼卵、仔稚鱼进行分类鉴定。该方法鉴定准确度高，消耗时间短，工作量小，克服了以往方法的不足之处，显示了其快速、准确、高效的优势。

具体实施方式

本发明为一种鱼卵、仔稚鱼分类鉴定的方法，采用一下步骤：

1、在调查水域采集成鱼样本，并对成鱼样本进行分类鉴定，取新鲜肌肉或鳍条组织，用无水乙醇固定，蛋白酶K消化，酚-仿常规方法抽提DNA，-20℃保存备用；

2、选择相对保守的COⅠ序列片段，选用通用扩增引物为：Forward primer：5-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3，Reverse primer：

5-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3；

3、PCR扩增反应体系为：95℃预变性3分钟；每一个循环94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，共30个循环；最后72℃延伸6分钟；

4、PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用纯化试剂盒回收，测序；

5、将各种鱼类的COⅠ序列汇总，建立COⅠ序列数据库；

6、在调查水域采集的鱼卵、仔稚鱼样本用无水乙醇固定，随机挑选一部分样本并编号，按照步骤1所述方法提取DNA并保存于-20℃备用；

7、按照步骤2-4所述实验程序，测序获得各鱼卵、仔稚鱼样本的COⅠ序列；

8、将已获得的各鱼卵、仔稚鱼样本的COⅠ序列与已建立的COⅠ序列数据库进行比对分析，对鱼卵、仔稚鱼样本进行分类鉴定。