[发明专利]提高咀嚼式口器昆虫RNA干扰效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种提高咀嚼式口器 昆虫RNA干扰效率的方法。

背景技术

小分子量RNA(smallRNA)是一类长度约为20-30个核苷酸(nt) 的非编码RNA分子。自从1995年首次在线虫中发现以来，由于它具有 特殊的生物学功能作用，因此越来越受到有关科学工作者的关注。根 据合成途径可将小分子量RNA分成小分子量干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)两种类 型。当一些小分子量的内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子导入寄主细胞之后，便会诱发与之同源的内源 mRNA发生特异性的降解作用，从而高效且特异地阻断了体内同源基 因的表达活性，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的 现象，即出现RNAi(RNA干扰，RNAinterference)。这是生物界普遍 存在的一种在转录后调节基因表达的有效方式。

将siRNA导入细胞或动物体内，使特定基因表达沉默，又被称为 基因敲除。目前，已经在线虫、果蝇、小鼠、大鼠等动物体内实现了 多种基因的表达抑制，显示了RNAi在功能基因组学和基因治疗等领 域的广阔应用前景。目前对昆虫进行RNAi的操作技术已经比较成 熟，主要注射、饲喂、浸泡和转基因植物组织培养等方法。较为常用 的将siRNA导入昆虫体内的方法主要是注射法和饲喂法，注射法要求 有特殊的设备，而且由于注射本身的机械损伤会引起昆虫较高的死亡 率；饲喂法较为简便，但存在作用较慢、效率较低的特点。因此，提 高饲喂法的干扰效率对于进一步研究相关昆虫基因功能有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高咀嚼式口器昆虫RNA干扰效率的 方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种提高咀嚼式口器昆虫RNA 干扰效率的方法，包括以下步骤：

1)用无RNA酶的水将靶基因特异性siRNA配成一定浓度的溶液；

2)将人工饲料加工成3～5mm厚、直径1～2cm的圆片，置于24孔 板中；

3)取1)的溶液加在2)的圆片上，使溶液被饲料完全吸收；

4)将初孵的咀嚼式口器昆虫幼虫，放入3)的有饲料圆片的24 孔板中，饲喂一段时间后，检测昆虫中靶基因的表达量。

前述的方法，步骤1)所述溶剂包括但不限于水。

前述的方法，步骤1)用无RNA酶的水将靶基因特异性siRNA配 成浓度0.015nmol/L的溶液。

前述的方法，步骤2)人工饲料经干燥后，加工成3～5mm厚、直 径1.5cm的圆片，置于24孔板中。例如，若饲料太湿，可以稍微风干 30min,以便于吸收siRNA。

前述的方法，步骤3)具体为：取1)的溶液60-80μl(优选75μl) 加在2)的圆片上，使溶液被饲料完全吸收。

前述的方法，步骤4)将初孵的咀嚼式口器昆虫幼虫，放入3)的 有饲料圆片的24孔板中，饲喂2～4天(优选2天)后取样，提取总RNA， 反转录成cDNA，用荧光定量PCR检测昆虫中靶基因的表达量。

前述的方法，所述靶基因包括但不限于氨肽酶N(APN)基因， 其特异性siRNA序列为：5'-GCAACUACUCCAUCGCCAUTT-3'。

前述的方法，所述昆虫包括但不限于棉铃虫。

本发明通过对饲喂昆虫siRNA的方法进行改进，建立一种提高咀 嚼式口器昆虫RNA干扰效率的方法。该方法高效、简单，可操作性强， 节约了siRNA的用量，干扰效果明显，为研究咀嚼式口器昆虫基因的 功能提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中利用荧光定量PCR检测RNA干扰沉默棉 铃虫APN基因的表达的结果；其中，CK代表空白对照，GFPsi代表GFP 基因siRNA，APNsi代表APN基因siRNA，APNsi-C代表APN基因siRNA 的传统饲料混合法对照。

具体实施方式