[发明专利]一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种用于蚋类昆虫(黑蝇)分类 和鉴定的引物及其制备方法和应用。

背景技术

蚋虫，属双翅目长角亚目蚋科(Simulidae)，俗称黑蝇(blackfly)、驼背(挖背) 和刨锛。古代又称蜹，是医学昆虫中呈世界性分布的一个重要类群。它不但骚 扰吸血，侵袭人畜，而且是人类和禽畜类多种疾病的传播媒介，其中包括人盘 尾丝虫病(Onchocerciasis)、畜类盘尾丝虫病和由欧氏曼森线虫(Mansoneila Ozzanli)引起的曼森丝虫病及禽鸟住白细胞虫病(Leucocytozoonsis)等疾病。由于 蚋具群舞习性，成群地在人头部飞行骚扰，可引起人情绪波动，表现为烦躁不 安、易激怒等。由于蚋类个体较小且种间形态差异较小，在昆虫分类界是分类 学一大挑战，形态分类局限于国内极少数专家，不能全面快速地进行种类鉴别， 对是否携带河盲症、盘尾丝虫病原的蚋的分布也不能做出识别，不能有效地做 出预警与分析，不能对防治措施的有效制定提供基本信息及数据。

现有针对蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物如COI等在种间表现良好但 在种下表现较差，其他引物如ND4，ITS等也存在应用范围有限，使用效果较 差，操作比较繁琐等缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其 制备方法和应用，旨在解决现有针对蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物，应 用范围有限，使用效果较差，操作繁琐的问题。

本发明是这样实现的，一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物，所述用于蚋 类昆虫分类和鉴定的引物序列：

SEQIDNO：1TATGTACTACCATGAGGACAAATATC

SEQIDNO：2AGCAAATAAAAAATATCATTC。

进一步，所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物片段370bp。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物的制 备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤一，总DNA的提取，采用试剂盒法，用100μL洗脱液溶解提取的样 品，采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行样品检测或者置于-20℃ 保存、备用；

步骤二，引物筛选，选出备选上游引物13条，下游引物13条，引物序列 SEQIDNO：1与SEQIDNO：2的组合；

步骤三，以所得基因组DNA为模板，利用上述两对引物对基因组DNA中 的线粒体cytb基因进行PCR扩增；

步骤四，取适量的PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色 后于紫外灯下观察，两对引物扩增的片段大小分别为400bp，将得到的特异性 产物测序，利用Chromas2.4软件读取测序结果。

进一步，所述PCR反应体系和条件为：PCR反应体系为25μL，含2×PCR Mastermix12.5μL，正/反向引物各3μL，DNA模板2μL，含20～50ng DNA，ddH₂O补足25μL；

PCR反应条件为：94℃下预变性2min；而后35个循环，每个循环包括 94℃变性30s，41-51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

进一步，所述蚋类分子鉴定引物的使用方法，使用1％琼脂糖电泳检测。

本发明提供的用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其制备方法和应 用，引物cytb组合来自于ChrisSimon1994，上下游为自己组合，在现有技术中 引物未被使用也未被应用于蚋类昆虫(黑蝇)分类中去，未见相关蚋类昆虫(黑 蝇)鉴定文章使用过此引物；本发明的引物片段约370bp，易扩增，在不同种间 的表现良好，相较其他引物，对于种下分化的表现要优异一些；比应用于蚋类 昆虫(黑蝇)的其他cytb引物比要适用范围更广。

本发明运用此引物技术与现有技术相比具有：

1、结果准确可靠：已经对采自中国的8种蚋虫进行鉴定验证，结果的可靠 性具有充分的保证。

2、操作简便：应用本发明方法，鉴定蚋类昆虫，一般的普通实验人员即可 完成，不需要专业的形态学鉴定知识。