[发明专利]一种利用代谢基因工程提高硅藻油脂含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种利用代谢基因工程技术、通过导入内源甘油-3-磷酸酰基转移酶基因提高硅藻油脂含量的方法。

背景技术

生物柴油(Biodiesel)是指来自生物体的油脂(主要为甘油三酯)与醇类(甲醇或乙醇)经酯交换作用而形成单烷基脂肪酸酯。生物柴油的性能跟石化柴油基本相当，具有良好环保性和生物降解性，已成为国际上应用最广、发展最快的理想可再生能源。

单细胞真核微藻是光合自养型的低等水生植物，种类繁多，分布广泛，具有光合作用效率高，生长快速，生物量大等特点。部分来自绿藻门和硅藻门的微藻种类油脂含量较为可观，已成为制备生物柴油的优质天然原料，与木本油料植物(油桐、麻疯树、黄连木等)相比，海洋微藻养殖不占用耕地、不消耗淡水，是未来生物柴油发展的研究热点。

目前，微藻生物柴油的生产能耗和高昂成本是阻碍其产业化的关键问题。改进微藻培养技术、优化产油条件以及微藻产物分离方法，特别是提高微藻自身的产油能力，是降低制备成本、提高生物柴油的产量和质量的重要途径，其中，经筛选、诱变或基因工程定向育种获得含油量高的优质藻种极为关键。

微藻与高等植物的脂类合成途径基本相同。质体中脂肪酸合成的前体物为乙酰-CoA，两个乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶的催化作用下合成丙二酰-CoA。然后，以丙二酰-CoA为底物，在脂肪酸合成酶系(FAS)催化下进行连续的聚合反应，每次循环都以增加两个碳的方式合成酰基碳链，最终在硫酯酶的催化下生成16至18碳的饱和脂肪酸。游离脂肪酸通过质体膜的转运进入胞质中，大都以酰基CoA形式存在，经三种不同酰基转移酶的催化最终合成甘油三酯，这三种酶均位于内质网膜上，可定义为甘油三酯组装酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶和二酰甘油酰基转移酶，它们分别作用于甘油骨架的Sn-1、Sn-2和Sn-3位。

植物脂类合成途径的解析为油脂代谢基因工程提供了遗传操作的靶点。其中，最初步骤的乙酰-CoA羧化酶和最终步骤的二酰甘油酰基转移酶是最常见的靶点，采用策略是通过基因工程，实现同源或异源上述基因的过表达，最终增加甘油三酯的含量。

乙酰-CoA羧化酶是脂肪酸从头生物合成的关键限速酶，可调控碳流进入脂肪酸生物合成途径。油菜和土豆中的研究表明，基因导入可有效提高甘油三酯含量，但在海洋硅藻中未获成功。二酰甘油酰基转移酶的底物二酰甘油有两条去路：合成磷脂或者甘油三酯，因此，二酰甘油酰基转移酶也是合成甘油三酯的关键酶和限速酶。高等植物与微藻油脂代谢基因工程研究表明，向细胞中导入二酰甘油酰基转移酶基因并使之过表达，可以导致二酰甘油更多合成甘油三酯。

由于进化上硅藻与高等植物相比具有明显差异，极有可能存在特殊的油脂合成积累调控机制，例如，近期研究发现，硅藻中来自细胞糖酵解与支链氨基酸降解的碳流导致了硅藻细胞的油脂积累，这与高等植物明显不同。因此，很有必要针对硅藻油脂代谢途径中的酶编码基因，寻找适合硅藻油脂代谢基因工程操作的全新靶点。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种利用代谢基因工程技术、通过导入内源甘油-3-磷酸酰基转移酶基因提高硅藻油脂含量的方法。

为实现上述目的，本发明技术方案如下：一种利用代谢基因工程技术提高硅藻油脂含量的方法，将硅藻中的甘油-3-磷酸酰基转移酶作为硅藻油脂代谢基因工程调控的靶点，克隆硅藻甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，构建表达载体，再导入硅藻细胞，经筛选和检验获得油脂含量提升的转化藻株。

所述方法具体步骤为：

1)克隆硅藻甘油-3-磷酸酰基转移酶基因，利用cDNA序列构建酵母表达载体；

2)利用酵母甘油-3-磷酸酰基转移酶突变体的回复突变验证该基因功能；

3)构建硅藻表达载体，导入硅藻细胞，经筛选和检验获得油脂含量提升的转化藻株。

所述硅藻为三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、小环藻(Cyclotellasp.)等产油海洋硅藻。

所述硅藻表达载体包含硅藻内源启动子、终止子等基因表达调控元件，以及除草剂草丁膦抗性基因。

所述筛选为将转化细胞涂布含有一定剂量除草剂草丁膦的平板，培养抗性转化子。

与现有方法相比，本发明提出了一种新思路，具有如下有益效果：