[发明专利]一种利用融合表达提高酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用融合表达提高酵母发酵生产葡萄糖二酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

葡萄糖二酸及其衍生物是自然界存在的一种无毒成分，在一些植物及哺乳动物中均有发现，特别是在一些十字花科蔬菜、苹果和柑橘类水果中含量丰富。葡萄糖二酸具有重要的生理功能，广泛的应用于食品、化工、医药等领域，被美国能源部确定为“最有价值的生物炼制产品”。它可以降低胆固醇、用于糖尿病的治疗，预防及辅助治疗癌症，同时其钙盐也是一种食品添加剂。葡萄糖二酸又是羟基化尼龙、聚酰胺类聚合物的基本聚合单位，可用于合成环保型的可降解聚合物，用于洗涤剂中替代磷酸盐的使用等。葡萄糖二酸其结构与单糖结构相似，可以通过糖转运系统进入细胞内部，能够在病灶部位聚集，并少量被缺血组织快速吸收，因此可以作为显像剂应用于心肌梗死和肿瘤的研究中。

目前葡萄糖二酸的制备方法主要为化学法，如硝酸氧化、以2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)及其衍生物为催化剂的共催化氧化及光催化氧化等。硝酸氧化法主要是以葡萄糖为原料，通过硝酸氧化为葡萄糖二酸及其小分子物质。此种方法生成的产物较多，副产物复杂，同时产生大量气体，其反应废液对环境产生污染，因此逐渐被新方法取代。TEMPO氧化体系对糖类伯羟基的氧化选择性高、反应条件温和、能避免降解。由于葡萄糖二酸的水溶液易形成葡萄糖1，4-内酯及葡萄糖6,3-内酯，所以在制备过程中以制得单钾盐为最终产物。此方法所用TEMPO可回收利用，产物纯化容易，便于操作，是目前常用的一种方法。但是由于反应过程中的反应温度及pH不易控制，因此仍然需要改进。

由于化学法所存在的局限较多，通过生物法来制备葡萄糖二酸越来越受到研究者的关注。葡萄糖二酸是存在于哺乳动物的代谢途径中，它与抗坏血酸是葡萄糖醛酸代谢途径的终产物。然而，从D-葡萄糖或D-半乳糖到葡萄糖二酸，至少需要10步反应。Prather等通过重组大肠杆菌，分别从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和小鼠体内获取肌醇-1-磷酸合成酶(Ino1)和肌醇氧化酶(MIOX)，从丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)获得醛酸脱氢酶基因，克隆到大肠杆菌中，实现了葡萄糖二酸的生物合成。发明人之前通过构建重组酵母菌株，表达肌醇氧化酶(MIOX)及醛酸脱氢酶(Udh)成功实现了葡萄糖二酸的生成。但是葡萄糖二酸还有待提高。

本发明采用融合酶的分子设计策略，将醛酸脱氢酶(Udh)融合在肌醇氧化酶(MIOX)的N端，采用的构建方式为直接融合及通过添加连接肽进行融合。本发明中构建的新型重组工程菌进一步提高了葡萄糖二酸的产量，为高产葡萄糖二酸提供了新的思路。

发明内容

本发明通过将肌醇加氧酶基因(miox)及醛酸脱氢酶基因(udh)通过融合，克隆表达至酵母菌株中，构建重组酵母，该重组酵母菌能以葡萄糖、甘油、蔗糖或者肌醇为底物合成葡萄糖二酸。

本发明的第一个目的是提供一种重组酵母菌，该重组酵母菌融合表达肌醇加氧酶MIOX和醛酸脱氢酶Udh。

所述肌醇加氧酶基因miox，在本发明的一种实施方式中，来源于以下任意一种：小鼠(mouse)、毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)、白假丝酵母(Candida albicans)。

所述醛酸脱氢酶基因udh，在本发明的一种实施方式中，来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。

所述肌醇加氧酶和醛酸脱氢酶，在本发明的一种实施方式中，醛酸脱氢酶是NCBI上登录号为BK006380的酶；肌醇加氧酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.29所示。

所述肌醇加氧酶，在本发明的一种实施方式中，其核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示。

所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是将醛酸脱氢酶基因udh融合在肌醇加氧酶基因miox的N端。

所述融合表达，在本发明的一种实施方式中，是直接融合表达或者使用连接肽进行融合表达，即将两个酶的编码基因首尾相连(去掉第一个酶的终止密码子)直接融合，或者通过连接肽将两个酶的编码基因融合。