[发明专利]一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法。

背景技术

杨树分布广，适应性强，是具有重要经济价值的优良阔叶树种。杨树生长快，容易繁殖，易于基因工程操作，被认为是林木基因工程中的理想模式树种。根癌农杆菌介导法是目前杨树遗传转化中应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种外源基因转化方法。根癌农杆菌介导法具有以下优点：操作简便；外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝；转移DNA片段明确，可转移大片段DNA；可直接用不同的植物组织进行基因转移等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化的转化效率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法。

本发明所提供的根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：

M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；

M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；

所述外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将所述近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到所述外植体。

上述方法中，所述近叶柄端半叶片可为所述叶片的主叶脉清晰部分。

上述方法中，所述用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体可包括H1)和H2)：

H1)用MS侵染液重悬所述重组根癌农杆菌的菌体得到农杆菌侵染液；

H2)用所述农杆菌侵染液转染杨树的外植体得到所述转染的外植体。

上述方法中，所述MS侵染液可为向MS液体培养基中加入MES、葡萄糖和AS得到的液体，其中所述MES、所述葡萄糖和所述AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、200μM。

上述方法中，所述转染的时间可为10-30分钟。所述10-30分钟具体可为15分钟。

上述方法中，所述杨树组培苗按照如下方法获得：将无菌杨树顶芽接入生根培养基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。

其中，所述生根培养基为向MS培养基中加入NAA得到的固体培养基，其中NAA的浓度为0.1mg/L。

上述方法中，所述杨树组培苗也可按照如下方法获得：将无菌杨树叶片接入分化培养基在光照下进行培养得到无根组培苗；将所述无根组培苗接入所述生根培养基在光照下培养15-30天得到所述杨树组培苗。

其中，所述分化培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA和TDZ得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA和所述TDZ的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L。

上述方法中，所述15-30天具体可为18-22天。所述18-22天具体可为20天。

上述方法中，所述培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括A1)-A5)：

A1)共培养所述转染的外植体，得到共培养的外植体；

A2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；

A3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；

A4)将所述抗性丛生芽进行增殖培养得到抗性幼芽；

A5)将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。

上述方法中，所述共培养所述转染的外植体为将所述转染的外植体在共培养基上于24-25℃下黑暗中培养3天。所述共培养基为向MS培养基中加入MES、葡萄糖、NAA、6-BA和AS得到的固体培养基，其中，所述MES、所述葡萄糖、所述NAA、所述6-BA和所述AS的浓度分别为500mg/L、10g/L、0.1mg/L、0.2mg/L、200μM。

所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养。所述恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L。