[发明专利]一套提高根癌农杆菌介导的杨树遗传转化效率的方法

权利要求书

1.根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法，包括M1)和M2)：

M1)用含有目的DNA的重组根癌农杆菌转染杨树的外植体得到转染的外植体；

M2)培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株；

所述外植体的制备方法如下：将杨树组培苗的叶片从垂直主脉方向一分为二，得到近叶柄端半叶片和远叶柄端半叶片；将所述近叶柄端半叶片的叶边缘去除得到所述外植体；

所述杨树组培苗按照如下方法获得：将无菌杨树顶芽接入生根培养基在光照下培养20天得到所述杨树组培苗；

所述培养所述转染的外植体得到外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括A1)-A5)：

A1)共培养所述转染的外植体，得到共培养的外植体；

A2)将所述共培养的外植体进行恢复培养，得到恢复培养的外植体；

A3)将所述恢复培养的外植体进行分化培养得到抗性丛生芽；

A4)将所述抗性丛生芽进行增殖培养得到抗性幼芽；

A5)将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株；

所述将所述抗性幼芽进行培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株包括B1)、B2)和B3)：

B1)将所述抗性幼芽进行生根培养得到抗性植株；

B2)将所述抗性植株的顶芽进行二次生根培养得到根成放射状生长的杨树转基因植株；

B3)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述恢复培养为将所述共培养的外植体在恢复培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养；所述恢复培养基为向MS培养基中加入NAA、6-BA、TDZ和特美汀得到的固体培养基，其中所述NAA、所述6-BA、所述TDZ和所述特美汀的浓度分别为0.1mg/L、0.2mg/L、0.01mg/L、250mg/L；

所述增殖培养为将所述抗性丛生芽在增殖培养基上于25℃、16h光照/8h黑暗下培养；所述增殖培养基为向MS培养基中加入卡那霉素和特美汀得到的固体培养基，其中所述特美汀的浓度为250mg/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述恢复培养的时间为5-10天。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述将所述根成放射状生长的杨树转基因植株进行二次分化培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株，包括D1)和D2)：

D1)将所述根成放射状生长的杨树转基因植株的叶片进行二次分化培养得到二次分化无根组培苗；

D2)将所述二次分化无根组培苗进行生根培养得到所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述根癌农杆菌介导的杨树遗传转化方法还包括将所述外源基因稳定表达的杨树转基因植株进行炼苗和移栽的步骤。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述杨树为山新杨(Populus davidiana×P.bolleana)或欧美杨107(P.euramericana)或毛白杨(P.tomentosa)。