[发明专利]一种添加Fe2+提高大肠杆菌工程菌合成5‑氨基乙酰丙酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种添加Fe²⁺提高大肠杆菌工程菌合成5-氨基乙酰丙酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式为C₅O₃NH₉，分子量为131.13，熔点为149-151℃，它是生物体合成叶绿素、血红素、维生素B₁₂等关键前体物质。ALA作为一种安全、选择、渗透性好的光动力学药物在医学领域逐渐受到重视，已成功应用于皮肤癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的诊断和光动力治疗中。另外，由于ALA在自然界中可降解，在农药领域应用也非常广泛，如作为一种无公害的新型光活化农药、除草剂以及植物生长调节剂等。

目前，ALA主要合成方法是化学法合成，最早出现在上世纪50年代，到20世纪90年代，相关研究开始大量开展，并取得一定的成绩。但是由于化学合成反应步骤繁琐，副产物多，分离提纯困难，ALA的得率也较低，并且环境污染严重等问题，近年来，微生物发酵生产ALA已成为研究的热点。自然界中，ALA的生物合成存在两条途径，一条是C4途径，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA编码)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反应组成，主要存在于一些光合细菌、真菌以及动物体内。另外一条是C5途径，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX编码)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA还原酶(GluTR，hemA编码)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基转移酶(GSA-AT，hemL编码)催化生成ALA。该途径广泛存在于植物、藻类以及细菌(如大肠杆菌)中。

早期，人们筛选到产ALA的光合细菌类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，通过诱变育种法对其进行诱变，筛选ALA的高产菌株，并通过发酵优化等使得ALA的产量达到7.2g/L。但由于光合细菌的特殊性，其成本较高，不适合大规模的工业化生产。随着基因工程技术的成熟，Mariet和Zeikus选用大肠杆菌作为宿主细胞，采用基因工程的技术表达来源于R.sphaeroides的ALA合酶基因(hemA)，ALA产量为3.79g/L。Xie et al.等利用过量表达R.sphaeroides来源的hemA基因，经发酵优化，ALA产量最高达到5.2g/L。但目前以C4途径为基础的生物转化由于添加前体琥珀酸和甘氨酸生产ALA成本相对较高，Kang et al.等通过分析大肠杆菌中C5途径的调控机制，发现ALA合成C5途径的关键基因hemA和hemL，同 时实现了以葡萄糖为唯一碳源发酵生产ALA。

本发明在表达5-氨基乙酰丙酸C5合成途径关键酶基因hemL和hemA和表达来源于大肠杆菌血红素生物合成途径基因hemD及hemF的基础上，通过添加Fe²⁺及优化添加量，实现了ALA产量的进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种提高大肠杆菌工程菌株产5-氨基乙酰丙酸的方法，是控制初始发酵培养基中Fe²⁺浓度为0.0036-0.036mMol/L，实现ALA产量的进一步提高。

所述大肠杆菌工程菌株是以大肠杆菌为宿主，使用不同拷贝数的表达载体过量表达谷氨酰-tRNA还原酶(hemA编码)、谷氨醛氨基转移酶(hemL编码)、尿卟啉原III合酶(hemD编码)和粪卟啉原III氧化酶(hemF编码)。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述不同拷贝数表达载体分别为pRSFDuet-1和pETDuet-1。

在本发明的一种实施方式中，所述hemL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemD的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述hemF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，以pRSFDuet-1表达hemA、hemL、hemF，以pETDuet-1表达hemD，将两个质粒转入大肠杆菌得到大肠杆菌工程菌株。