[发明专利]根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种用于培养间充质干细胞的方法，包括分离尺寸小于等于8μm的间充质干细胞，并将它们在含钙和镁的培养基，以及在低氧条件下进行培养。本发明的方法可以显著提高间充质干细胞的细胞增殖能力和分化潜能。

技术领域

本发明涉及一种根据细胞尺寸来培养间充质干细胞的方法。尤其涉及一种用于尺寸小于等于8μm的间充质干细胞的分离，以及将它们在特定条件下培养的方法。

背景技术

术语“干细胞”是在胚胎、胎儿和成人的组织中发现的一种未分化类型的体细胞的通称，它具有分化成多种特定细胞类型的潜能。

干细胞根据其潜能可以分类为：多潜能干细胞(pluripotent stem cells)，多能干细胞(multipotent stem cells)和专能干细胞(unipotent stem cells)，多潜能干细胞具有分化成任意类型细胞的多潜能性。胚胎干细胞和诱导性多潜能干细胞(inducedpluripotent stem，iPS)是多潜能干细胞的代表。成体干细胞表现出多能性和/或单能性。其中包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等。

尽管在细胞治疗中利用人胚胎干细胞的多潜能性进行了许多尝试，但是仍然保持着肿瘤发生和免疫排斥反应的高可能性，并且这是难以克服的障碍。

至于iPS细胞，它们是通过重编程特意由已分化的成年体细胞回归到它们最初的胚胎干细胞阶段的一类干细胞。由于其是自体细胞，因此iPS细胞可避免免疫排斥反应的风险，但iPS细胞的肿瘤发生风险仍然是需要解决的问题。

间充质干细胞已被提作解决这些问题的一种替代选择，因为它们表现出免疫调节作用且没有表现出肿瘤发生风险。间充质干细胞是可以分化成多种细胞类型的多能干细胞，并且被熟知具有调节免疫应答的功能，所述多种细胞类型包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、成心肌细胞、肝细胞、胰岛β细胞、血管细胞等。

间充质干细胞可分离自多种组织(例如骨髓、脐带血、脂肪组织等)，但可能不能对其进行充分定义，这是因为根据间充质干细胞衍生的来源，彼此的细胞表面标记物具有一些差异。一般来说，如果它们可以分化成成骨细胞、软骨细胞和成肌细胞，具有纺锤体形态，并且表达表面标记物CD73(+)、CD105(+)、CD34(-)和CD45(-)，则可将这种干细胞定位为间充质干细胞。在这种情况下，不同遗传来源和/或背景的间充质干细胞在标准定义下彼此不具有显著差异，但是彼此在体内活性方面具有显著差异。另外，当使用间充质干细胞作为外源细胞治疗剂时，有限的间充质干细胞的池(pool)并不允许进行其他可用选择，甚至不管低的体内活性。

此外，为了将间充质干细胞应用到临床实践，考虑到从组织中所获得的间充质干细胞的数量有限，在初始阶段获得大量细胞以及将细胞传代培养是非常重要的。然而，间充质干细胞会在传代中形成一个异质群体，这将影响到细胞的增殖、分化和老化，这使得间充质干细胞很难被发展为治疗试剂。

为了努力克服以上问题，Li J等,Cell Research,2008；Majore I等,CellCommunication and Signaling,2009，Rataiczak MZ等,Aging,2012等公开了许多用于培养间充质干细胞的方法。然而，这些方法具有一些缺点：异质细胞是通过这些方法获得，这使得很难获得用于大量生产的必要数目的细胞，而且细胞的增殖能力在每次传代之后降低，细胞的老化进展加快。此外，上述文献中所使用的设备并不适用于良好操作规范(GMP)，这使得将其应用于实际生产过程很困难。因此，需要一种低成本提取均匀细胞群和使细胞有效地大量增殖的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明因此，本发明的一个目的是提供一种有效培养间充质干细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供采用所述方法制得的间充质干细胞，所述间充质干细胞在增殖能力和分化潜能有改善。