[发明专利]一种提高棉花转基因效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及棉花转基因技术领域，具体地说，涉及一种提高棉花转基因效率的方法。

背景技术

利用基因工程技术对棉花进行遗传改良已取得重要进展。1987年Umbeck等首次报道通过农杆菌介导法将抗卡那霉素基因转入棉花(Umbeck P.Genetically transformed cotton(Gosspium hirsutum L.)Plants.Bio/Teehnology,1987,5:263～266)。传统的遗传转化方法转化周期长、植株再生的基因型依赖性强、再生苗畸形率高、移栽成活率低，成为限制棉花转基因育种研究的瓶颈。

棉花茎尖具有直接分化再生的特点，一经转化就可以在适当培养条件下诱导叶、根的形成而获得转基因植株。农杆菌介导的茎尖转化方法不仅能够解决基因型依赖性问题，还可缩短转化周期和提高移栽成活率。Renfroe等利用棉花茎尖分生组织获得再生植株以来，国内外很多学者也相继利用茎尖分生组织获得了棉花再生植株(Renfroe MH&Smith RH.Isolation and culture of cotton protoplasts.Proc.Beltwide Cotton Prod.Conf.,Natl.Cotton Council,Memphis,1986,TN:79–80)

吕素莲等利用棉花茎尖遗传转化方法将胆碱脱氢酶基因betA和突变的乙酞乳酸合成酶基因als成功转入到3个棉花优良品种中，并获得了抗除草剂氯磺隆和耐盐性提高的转基因植株及后代(吕素莲等.农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化及转betA植株的产生.高技术通讯，2004，11:20-25.)。但该技术方案主要是体外茎尖转化法，没有经过棉花细胞和组织培养过程，嵌合体几率增加，不能稳定遗传，后代不符合孟德尔遗传规律。然而，许多经过了细胞和组织培养的棉花转基因方法(如通过下胚轴转化的方法)，由于下胚轴要经过愈伤组织的诱导及分化，转化周期较长，一般6-9个月(刘明月，农杆菌介导棉花遗传转化体系优化，2011，第9页)，且受转化受体基因型的限制。还有一些茎尖为受体的基因枪转化方法，但较农杆菌转化方法而言，费用高，且有瞬时表达和嵌合体现象发生。有其他农杆菌介导的茎尖转化方法表明，从共培养到获得抗性株需3-4个月，周期较长(徐大伟等，2011年，中国农学通报)。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种缩短棉花转化周期，提高棉花转基因效率的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种提高棉花转基因效率的方法，所述方法含有以下步骤：

a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；

b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；

所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素(KT)和浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。

进一步地，侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上在21℃下暗培养48小时。

进一步地，共培养后将棉花茎尖转入筛选培养基上培养12-15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。

进一步地，所述棉花无菌苗茎尖的培养方法为：将棉籽剥壳后露出棉仁，在无菌环境中用75％的酒精消毒1min，0.1％升汞消毒12min，再用无菌水清洗3-4次后，加入无菌水置于100rpm摇床中28℃培养至吸胀露白，置于种苗培养基上，28℃下暗培养2-3d后，将棉花无菌苗去掉子叶及叶原基，露出生长点并用解剖刀划伤生长点，留取子叶下部约0.5～1.0cm部分成为棉花无菌苗茎尖。

本发明还提供了一种提高棉花转基因效率的共培养培养基，所述共培养培养基含有0.3mg/L KT和0.2mg/L IAA。

进一步地，所述共培养培养基含有MSB₅、200μM乙酰丁香酮、30g/L葡萄糖和2.4g/L植物凝胶。

MSB₅是指MS无机盐和B5有机物。

本发明还提供了一种提高棉花转基因效率的筛选培养基，所述筛选培养基含有0.3mg/L KT和0.2mg/L IAA。

进一步地，所述筛选培养基含有MSB₅、200mg/L头孢霉素(cef)、80mg/L卡那霉素(kan)、15g/L葡萄糖、15g/L蔗糖、2.4g/L植物凝胶。

本发明还提供了前述共培养培养基和筛选培养基在提高棉花转基因效率中的应用。