[发明专利]一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

环糊精是由D-吡喃葡萄糖通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状化合物，其中以6、7和8个葡萄糖单元所构成的α-、β-和γ-环糊精最为常见。由于其呈中空圆筒状结构，具有外部亲水、内部疏水的特性，环糊精能与许多疏水客体分子形成包合物，从而改变客体分子的理化性质，因此，在食品、医药等工业领域中有着广泛的应用。

环糊精的工业化生产均采用酶法工艺，即在环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)催化作用下通过环化反应转化淀粉所合成。由于野生CGT酶作用淀粉生产环糊精的环化活力较低，使得环糊精的工业生产成本较高。

本发明中所使用的来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01的β-CGT酶总的环化活力约为302U/mg，因此，进一步提高该酶的环化活力，将更加有利于环糊精的工业化生产。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGT酶的第32位的天冬酰胺(Asn)分别突变为精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)或谷氨酰胺(Gln)。所得6种突变体分别命名为：N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q。

编码所述CGT酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，来源于环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)STB01。所述CGT酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述突变体N32R、N32K、N32H、N32E和N32D的方法。根据B.circulans STB01CGT酶的基因序列，分别设计并合成引入Arg32、Lys32、His32、Glu32、Asp32和Gln32密码子突变的引物，对基因进行定点突变，测定DNA序列，分别鉴别出编码N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。

所述方法包括以下步骤：

(1)利用快速PCR技术，以含野生CGT酶基因的表达载体cgt/pST为模板进行定点突变，所用引物分别是：

引入Asn32Arg突变的引物：

正向引物：5’-GCAATCCCGCCAGAAATCCGACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTCGGATTTCTGGCGGGATTGC-3’，下划线为突变碱基；

引入Asn32Lys突变的引物：

正向引物：5’-GCAATCCCGCCAAAAATCCGACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTCGGATTTTTGGCGGGATTGC-3’，下划线为突变碱基；

引入Asn32His突变的引物：

正向引物：5’-GCAATCCCGCCCATAATCCGACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTCGGATTATGGGCGGGATTGC-3’，下划线为突变碱基；

引入Asn32Glu突变的引物：

正向引物：5’-GCAATCCCGCCGAAAATCCGACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTCGGATTTTCGGCGGGATTGC-3’，下划线为突变碱基；

引入Asn32Asp突变的引物：

正向引物：5’-GCAATCCCGCCGATAATCCGACC-3’，下划线为突变碱基，

反向引物：5’-GGTCGGATTATCGGCGGGATTGC-3’，下划线为突变碱基。

引入Asn32Gln突变的引物：