[发明专利]一种环化活力提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

权利要求书

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第32位的天冬酰胺分别突变为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。

2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。

3.含有权利要求2所述核苷酸序列的载体或细胞。

4.一种获得权利要求1所述突变体的方法，根据SEQ ID NO.1所示的基因序列，分别设计并合成定点突变引物，对基因进行定点突变，获得编码N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q突变体的基因，并在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB600中进行表达。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述定点突变引物分别是：

引入Asn32Arg突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCAGAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTCTGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Lys突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCAAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTTGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32His突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCCATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTATGGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Glu突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCGAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTCGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Asp突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCGATAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTATCGGCGGGATTGC-3’；

引入Asn32Gln突变的引物：正向引物：5’-GCAATCCCGCCCAAAATCCGACC-3’，反向引物：5’-GGTCGGATTTTGGGCGGGATTGC-3’。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含突变质粒的表达宿主B.subtilis WB600的单克隆于含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的LB培养基中，在37℃、200r/min下培养8～12h，以体积比4％的接种量接种到含5μg/mL卡那霉素和10μg/mL赤霉素的TB培养基中，在37℃、200r/min下发酵48h；将发酵液于4℃、10000rpm离心20min以除去菌体，收集上清液并纯化，分别得到突变体N32R、N32K、N32H、N32E、N32D和N32Q。

7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶环化能力的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的CGTase的第32位天冬氨酸分别突变为精氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、赖氨酸或谷氨酰胺。

8.权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体在环糊精生产中的应用。