[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，涉及一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯。枯草芽孢杆菌分泌的脂肪酶A是一类在食品、医药、化工等领域具有良好应用前景的生物催化剂。枯草芽孢杆菌脂肪酶是最小的α/β折叠脂肪酶，且缺乏多数脂肪酶都具有的α螺旋形成的“盖子结构”，从而没有其它脂肪酶具有的界面激活效应。但是枯草芽孢杆菌脂肪酶A对温度极其敏感，在温度超过40℃时，其酶活会急剧下降。

酶的热稳定性是酶的重要属性之一，热稳定性酶具有提高化学反应速率、简化工艺、降低成本、提高产品质量、活性稳定、耐贮藏等优点。因而寻找耐温性酶，提高酶的热稳定性一直是生产和科研关注的热点。虽然目前已经有大量的关于酶热稳定性改造研究的报道，但是传统的理性设计方法受到蛋白质结构及功能关系复杂性的限制，而非理性设计方法则需要面临筛选容量大、过程复杂等难题，这两种方法各自的缺点在一定程度上限制了蛋白质改造领域的工作进展。

发明内容

本发明的技术目的是针对现有技术的不足，结合脯氨酸效应提出一种高效的计算机辅助筛选提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的方法。

本发明的技术目的可通过如下技术方案实现：基于脯氨酸效应提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A（Bacillus subtilis lipase A， PBD: 1I6W）热稳定性的方法，包括如下步骤：

1）获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构，通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域；

2）结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸（Gly）残基；

3）基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响；

4）构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体并验证其热稳定性，获得热稳定性得到提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株。

优选的，步骤1）所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构并通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域的方法为：通过检索蛋白数据库(Protein data bank)RCSB数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A（PBD: 1I6W）的晶体结构，使用软件Pymol0.9分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的三维结构,利用分子动力学方法，得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的Rmsf（Root mean square fluctuation）值，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域。

优选的，步骤2）所述的结合脯氨酸效应分析确定柔性较高区域的甘氨酸（Gly）残基的方法为：根据步骤1）得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF图，利用Pymol可视化软件，确定位于柔性较高Loop区域的Gly残基作为突变位点突变为Pro，分别为Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。

优选的，步骤3）所述的采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对稳定枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构的影响的方法为：通过分析均方根偏差RMSD（Root Mean Square Deviation）与均方根涨落RMSF（Root Mean Square Fluctuation）参数，来分析引入的Pro突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Gly52Pro和Gly158Pro。

优选的，分子动力学模拟技术具体为：所有动力学模拟均采用GROMACS4.5.4进行，体系在中性条件下，溶剂模型SPC，力场为GROMOS9653a6，温度为400K，相应地抗衡离子中和体系电荷；体系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）进行优化；然后固定蛋白，采用压力（Parrinello-Rahman）与温度（V-rescale）进行500 ps约束优化；最后进行分子动力学模拟，放松蛋白，时间步长为2 fs，模拟时间为10 ns。体系每隔1 ps收集一次数据。