[发明专利]一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的方法

权利要求书

1.一种提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A的热稳定性的方法，其特征在于包括如下步骤：

1) 获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构，通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域；

2) 结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸残基；

3) 基于对酶结构与功能关系的认知，采用分子动力学模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响；

4) 构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变体并验证其热稳定性，获得热稳定性得到提高的枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1）所述的获取枯草芽孢杆菌脂肪酶A晶体结构并通过分子动力学分析其蛋白结构中柔性较高的Loop区域的方法具体为：通过检索蛋白数据库RCSB数据库得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的晶体结构，使用软件Pymol0.9分析枯草芽孢杆菌脂肪酶A的三维结构，利用分子动力学方法，得到枯草芽孢杆菌脂肪酶A的Rmsf值，从而确定枯草芽孢杆菌脂肪酶A柔性较大的区域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2）所述的结合脯氨酸理论效应分析确定位于柔性较高Loop区域的甘氨酸残基的方法是：根据步骤1）得到的枯草芽孢杆菌脂肪酶A的RMSF图，利用Pymol可视化软件，结合脯氨酸效应理论,确定位于柔性较高Loop区域的Gly残基作为突变位点突变为Pro，分别为Gly153Pro、Gly155Pro、Gly158Pro、Gly111Pro、Gly116Pro、Gly46Pro、Gly52Pro。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）所述的采用分子模拟技术解析将相关甘氨酸位点置换为脯氨酸后对枯草芽孢杆菌脂肪酶A蛋白结构稳定性的影响的方法：通过分析均方根偏差RMSD与均方根涨落RMSF参数，来分析引入的Pro突变位点对枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的贡献，确定得到提高枯草芽孢杆菌脂肪酶A热稳定性的重要氨基酸位点是Gly52Pro和Gly158Pro。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于分子动力学模拟技术具体为：所有动力学模拟均采用GROMACS4.5.4进行，体系在中性条件下，溶剂模型SPC，力场为GROMOS9653a6，温度为400K，相应地抗衡离子中和体系电荷；体系首先采用最速下降法能量最小化（Steepest Descent）进行优化；然后固定蛋白，采用压力Parrinello-Rahman，与温度V-rescale进行500 ps约束优化；最后进行分子动力学模拟，放松蛋白，时间步长为2 fs，模拟时间为10 ns；体系每隔1 ps收集一次数据。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤4）所述的分子生物学构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变株的方法是采用全质粒扩增的方式进行突变：首先，设计分别含有Gly52Pro和Gly158Pro的引物，用primSTAR对全质粒进行扩增，突变质粒分别转入DH5α，涂布含有氨苄青霉素的LB平板，再转接到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中过夜培养；提取质粒，并转入BL21（DE3），涂布平板，构建枯草芽孢杆菌脂肪酶A突变菌BL21-pET22b-LipA。