[发明专利]一种可提高大肠杆菌耐热稳定性的蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种可提高大肠杆菌耐热稳定性的蛋白及其应用，属于基因工程及蛋白质工程领域。 

背景技术

嗜热菌是一类能够在高温下生长的微生物，它们大多生活在温泉、堆肥、工厂废水排放口以及火山口等处。研究结果表明，从这些微生物中分离的酶具有一些优良的生物学性质，如热稳定性、以及对化学和物理变性剂、有机溶剂、极端酸碱条件等不利因素的抗性等。这些性质不仅可作为设计和改造酶类的依据，而且在工业生产中极具应用价值，嗜热微生物、极端嗜热微生物及其产生的嗜热酶在食品、化工、制药和环保等方面有着广阔的应用前景。 

极端嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii，P.horikoshii)是一株可以在88-104℃下生存的极端嗜热菌。CutA蛋白是一类广泛存在于动物、植物、微生物的二价阳离子耐受蛋白，对铜、锌、镍、钴、钙等金属离子都具有一定得结合和耐受作用。来源于P.horikoshii的PhoCutA蛋白是一个只有12kD分子量的小蛋白，它在150℃下依然具有折叠结构，是一种极度耐高温的蛋白。对PhoCutA蛋白的晶体结构分析显示，PhoCutA蛋白折叠成了带有反向平行β键的三聚体结构，这个结构十分稳定，解释了其拥有对金属离子有良好的耐受性及抗高温特性的原因。将耐高温的PhoCutA蛋白应用到本身不具有高温耐受性的菌体或酶体系中，考察其对菌体及酶系产生的影响，将拓宽耐热蛋白的应用领域，为耐热蛋白应用的研究提供更好的理论依据。 

发明内容

本发明提供了一种可提高大肠杆菌耐热稳定性的蛋白，以Genbank登陆号为NP_142908.1所示的PhoCutA蛋白编码基因序列为出发序列，经序列优化后获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述CutA蛋白来源于极端嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii，P.horikoshii)。 

表达SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因工程菌也为本发明要求保护的范围。 

本发明还提供了一种提高大肠杆菌耐热稳定性的方法，其特征在于首先合成SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；将得到的核苷酸序列克隆到表达载体；将得到的表达载体转化大肠杆菌进行表达。 

具体步骤如下： 

1)采用化学全合成方法合成SEQ ID NO.1所示核苷酸序列； 

2)将步骤1)获得的SEQ ID NO.1序列NcoI、BamHI酶切后连接到大肠杆菌表达载体pETDuet-1，得到重组表达载体pETDuet-cutA； 

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)得到基因工程菌E.coliBL21-pETDuet-cutA。 

本发明还提供了一种PhoCutA蛋白在E.coliBL21(DE3)中表达及纯化蛋白的方法，具体步骤如下： 

将构建好的菌株在含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上活化，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄霉素的LB培养基过夜培养(12h)。以1%接种量转接于含有100μg/mL氨苄霉素的TB培养基，30℃培养4h后加入0.2mM的IPTG，25℃低温诱导培养8h。将发酵液4℃、4000rpm离心20min，弃上清，缓冲液重悬，充分混匀，冰上超声破碎；4℃、10000rpm离心30min，沉淀细胞残基，收集上清后使用镍亲和柱、凝胶层析柱纯化蛋白。 

测定菌体生长曲线的方法为： 

将菌株在含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基上活化，挑取单菌落接种于含有100μg/mL氨苄霉素的M9补充培养基过夜培养(12h)。以1%接种量转接于含有100μg/mL氨苄霉素的M9补充培养基，添加的IPTG浓度设为5个梯度(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.4mM)，分装在96孔细胞培养板中(每块培养板上每个IPTG浓度梯度设置8个平行样)。将培养板置于预热的96孔板振荡器上，900r/m、指定温度(37℃、42℃、45℃)进行培养，每60min测一次OD620的数值。所得生长曲线相关数据使用OriginPro软件进行拟合并求得最大比生长速率等参数。 

本发明提供的SEQ ID NO.1序列编码的蛋白能提高大肠杆菌对温度耐受性，具有很好的应用前景。 

附图说明：

图1是96孔板培养菌体示意图