[发明专利]一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法。

背景技术

目前国内外公认，消毒灭菌有效性的验证方法应能证明残留的污染微生物的概率和可能性应低于10^-6[United States Environmental Protection Agency.Assessment of Liquid and Physical Decontamination Methods for Environmental Surfaces Contaminated with Bacterial Spores Development and Evaluation of the Decontamination Procedural Steps[S].EPA,2012.]，利用生物指示剂验证消毒灭菌效果是国际公认的方法。

生物指示剂（bio-indicator，BI）是将适当载体染以一定量的特定微生物，用于指示消毒或灭菌效果的制品。我国卫生部2002年颁布的《消毒技术规范》规定，在进行消毒灭菌效果验证或生物指示剂自身评价时，生物指示剂菌片的载菌量应为1×10⁶～5×10⁶cfu/片，回收菌数应在5×10⁵～5×10⁶cfu/片，即要求BI菌片指示菌的回收率在50%～100%[卫生部卫生法治与监督司.消毒技术规范[S].中华人民共和国卫生部，2002.]。但是，采用该规范推荐的震荡洗脱方法，在实际工作中对生物指示剂菌片上指示菌的洗脱效果较差，回收率远达不到50%～100%。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法。

本发明所提供的提高生物指示剂菌片指示菌回收率的方法（或者为：从生物指示剂菌片中回收指示菌的方法），具体可包括如下步骤：

（1）将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠，用组织破碎仪进行破碎处理，得到破碎后样品；

（2）将所述破碎后样品进行涡旋震荡，振荡后用所述洗脱液进行稀释，得到稀释后样品；

（3）将所述稀释后样品用100-400目（如200目）细胞筛过滤，除去菌片碎屑，所得滤液为从所述生物指示剂菌片中获得的指示菌的菌悬液。

在步骤（1）中，所述进行破碎处理可为于10-30Hz（如30Hz）下震荡2-5min（如5min）。

在步骤（1）中，所述生物指示剂菌片与所述洗脱液的配比可为1片：（1-1.5ml），如1片：1ml。

在步骤（1）中，所述不锈钢珠的直径为所述离心管管口直径的25%-58%（如41.7%）。

在步骤（1）中，向所述离心管中加入的所述不锈钢珠的个数为1个。

在本发明中，步骤（1）中所述的组织破碎仪具体为德国QIAGEN公司生产的Tissuelyser II型组织破碎仪。

在本发明中，步骤（1）中所述的离心管为2ml PE圆底离心管，其管口直径为12mm，管长为40mm；对应采用的所述不锈钢珠的直径为3-7mm（如5mm）。

在步骤（1）中，在所述“将生物指示剂菌片置于装有洗脱液的离心管中，并加入不锈钢珠”后还包括将所述离心管加盖后用封口膜将封闭管口的步骤。

在步骤（2）中，所述进行涡旋震荡可为于1000-2500rpm（如25rpm）涡旋震荡1-3min（如2min）。

在步骤（2）中，振荡后用所述洗脱液进行稀释，为用所述洗脱液进行5-20倍（如10倍）稀释。

进一步，所述洗脱液的溶剂为0.03mol/L磷酸盐缓冲液，溶质及浓度如下：硫代硫酸钠10g/L、吐温-801.0g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠8.5g/L。

其中，所述0.03mol/L磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：无水磷酸氢二钠2.83g/L；磷酸二氢钾1.36g/L，pH7.2-7.4。

在本发明中，步骤（2）中所述进行涡旋振荡时采用的震荡器为德国IKA公司生产的Vortex GENIUS3型涡旋震荡器。

在上述方法中，所述生物指示剂菌片的载菌介质为滤纸。