[发明专利]一种提高普鲁兰多糖产量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种微生物发酵生产普鲁兰多糖的方法，具体涉及一种发酵过程中分段添加生长因子来提高普鲁兰多糖产量的方法。属于生物发酵工程技术领域。

背景技术：

普鲁兰多糖是一种水溶性的不定形葡聚糖并作为水溶性多糖的模式多糖，它已作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂和润滑剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。普鲁兰多糖将是今后新型发酵工程的一个重要发展方向，越来越受到国内企业的重视。

生长因子是指微生物生长过程中必须的，必须由外界直接提供的营养成分，常见的生长因子有维生素、氨基酸、嘌呤嘧啶等。生长因子可以提供微生物重要化学物质、辅助因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。普鲁兰多糖属于次级代谢产物，在菌体处于对数期后期，稳定期前期开始产生。

目前文献当中关于普鲁兰多糖产量提高主要是通过菌种诱变、培养基成分优化，往往效果不太明显，发酵周期长，且底物的转化率不高，导致普鲁兰多糖成本居高不下。申请号为201210594876.4的中国发明专利《大量生产普鲁兰多糖的诱变菌株及其培养方法》，公开了一株产普鲁兰多糖的出芽短梗霉CGMCC NO.7055，并公开了利用该菌株生产普鲁兰多糖的方法，以及发酵培养基组成。出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）BCSWGHPL101在发酵培养基发酵生产普鲁兰多糖产量为96g/L，较原始菌株68±5.2g/L的产量，提高了41.2%，发酵条件为28℃，200±20rpm下培养3d。但仍存在发酵周期较长，且底物转化率较低，底物利用率不高的问题，导致普鲁兰多糖成本较高，不利于大批量、规模化生产。

发明内容：

为了解决普鲁兰多糖传统优化过程中的不足，有针对性的提高普鲁兰多糖产量，缩短普鲁兰多糖发酵周期，提高底物转化率，本发明提供了一种分段添加生长因子来提高普鲁兰多糖产量的方法，不仅操作方便，而且在提高产量的同时也减少了色素的产生。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

1.一种提高普鲁兰多糖产量的方法，包括以下步骤：

1）种子培养

将出芽短梗霉菌株进行活化后挑一环转接到500ml挡板瓶中，培养基装液量100ml，培养温度为32℃，摇床转速为180rpm，培养时间为28-32h。

所述种子培养基组成：蔗糖8g，酵母浸粉0.2g，氯化钠0.15g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸铵0.1g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL。

2）发酵培养

500mL挡板瓶瓶装液量100mL，接种量为4％(V/V)，温度28℃，摇床转速为400rpm进行培养。菌体生长处于对数期初期时，加入0.03-0.05‰的维生素B₁，当菌体生长处于稳定期前期时，加入0.02-0.04‰的尿嘧啶核苷酸，培养57-63h，从而达到引导促进次级代谢产物即普鲁兰多糖的积累，提高底物转化率，缩短发酵周期。

所述发酵培养基组成：蔗糖10g，蛋白胨0.4g，氯化钠0.3g，磷酸氢二钾0.7g，硫酸镁0.04g，硫酸亚铁0.05g，蒸馏水定容至100mL，初始pH5.5-6.5。

所述维生素B₁及尿嘧啶核苷酸用去离子水配制成浓度0.01g/L的溶液然后通过0.45um无菌滤膜过滤制备。

3）普鲁兰多糖的分离

发酵液滤除菌体后，加入三倍乙醇，搅拌，4℃静置过夜，离心后，再使用无水乙醇冲洗2遍，干燥得白色普鲁兰多糖粗品。

所述出芽短梗霉BCSWGHPL101（Aureobasidium pullulans）是由实验室保藏的一株产色素量少的出芽短梗霉TKPM10017经筛选诱变获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。保藏日期2012年12月25日，保藏编号为CGMCC NO.7055。

所述出芽短梗霉TKPM10017产量比较稳定约50-60g/L，色素产生较少，但发酵周期较长，底物转化率较低。

所述诱变过程包括如下步骤：