[发明专利]一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

海藻糖合成酶（Trehalose synthase，EC5.4.99.16）是一种分子内葡糖苷转移酶，能够特异性地催化麦芽糖的α-1,4糖苷键转化为α-1,1糖苷键生成海藻糖。海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的一种非还原性双糖，具有在逆境下保护生物体的生物膜和生物大分子的特殊功能，能赋予低等动物、植物和微生物等抵抗营养缺乏、高温、高渗透压、干燥、有毒物质等恶劣环境的能力，因而在生物制品、食品、药品、作物育种及精细化工等领域有着广泛的应用前景。

酶合成法是生产海藻糖的主要方法之一，是利用酶制剂所具有的转糖基作用在离体条件下作用于麦芽糖、蔗糖等底物生产海藻糖，该方法具有较高的特异性、快速温和、生产成本低等特点。酶法生产海藻糖有多种生物合成途径，可由不同的酶分别催化淀粉、葡萄糖、麦芽糖、寡糖等合成海藻糖。

利用海藻糖合成酶以麦芽糖为底物合成海藻糖的流程仅需一步反应，海藻糖的产率高且不受底物麦芽糖浓度的影响，工艺简单，易于调控，是酶法生产海藻糖的最简单途径，因而海藻糖合成酶已被广泛应用于海藻糖的工业化生产。在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、脂肪杆菌（Pimelobacter sp.）、食尼古丁节杆菌 (Arthrobacter nicotinovorus)、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）和一些栖热菌 （Thermus）等菌株中都发现了海藻糖合成酶，但上述菌株细胞内的海藻糖合成酶含量低，酶的活性低，导致酶的生产成本较高，因此如何提高海藻糖合成酶的含量、降低生产成本是目前急需解决的技术问题。

研究发现当微生物细胞处于饥饿、高温、高渗透压等外界刺激时会发生应激反应，提高细胞内合成海藻糖酶系的活性，从而增加海藻糖产量以抵抗外界胁迫。目前对部分微生物在上述条件下细胞内海藻糖和海藻糖合成酶的变化已有一定的研究，如段作营（生物加工过程，2007.5）在进行热激对恶臭假单胞菌S1胞内海藻糖合成酶的影响研究时，采用热刺激的方法使海藻糖合成酶的酶活提高了76%；如中国专利文献CN 12190715A（申请号03129701.3）公开了一种以葡萄糖为基质两步发酵法生产酵母胞外海藻糖的方法，首先采用氮饥饿、热休克、渗透胁迫等方法，诱导酵母细胞产生较多的应激酶-海藻糖合成酶系，然后利用酵母细胞中的海藻糖合成酶系大量合成胞外海藻糖；外界压力也是一种刺激条件，生物反应器的压力对微生物胞内特定产物的含量也有显著影响，如中国专利文献CN 1480535A（申请号03130410.9）公开了利用高压提高酵母菌海藻糖产量的方法，该方法较常压对照条件下胞内海藻糖含量提高了20～70%。目前关于利用压力提高栖热菌海藻糖合成酶含量的研究还没有相关报道或专利。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法。

本发明采用的技术方案为：

一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法，其特征是，步骤如下：

（1）从试管斜面上挑取1-2环栖热菌菌株接种到液体种子培养基中，在65～70℃、100～150r/min下培养12～16h，制得活化后的液体种子，然后将液体种子按体积比3%～5%的接种量接种到液体培养基中，在60～70℃、150～200r/min下培养20～24h，制得菌株细胞培养液；

（2）将菌株细胞培养液置于压力反应器内，在0.5～2.0MPa压力下发酵1～6h，发酵条件为60～70℃、150～200r/min，制得发酵液；

（3）将发酵液离心，收集菌体细胞，破碎细胞，制得细胞破碎液，然后将细胞破碎液采用双水相萃取体系制备海藻糖合成酶。

所述步骤（1）中的栖热菌菌株为水生栖热菌（Thermus aquaticus ）ATCC33923或栖热菌属菌(Thermus sp.) ATCC 43815，以上菌株均保藏于美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC），可以通过购买的方式获得。

所述步骤（1）中的液体种子培养基的组分为：葡萄糖10g/L，酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH7.5，蒸馏水1000mL。