[发明专利]一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高光滑球拟酵母产丙酮酸的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有用化合物的前体，它在化工、制药和农用化学品等工业及科学研究中有着广泛的用途。作为一种重要的化工产品，传统化学法和生物发酵法生产丙酮酸都已实现工业化，传统化学法生产丙酮酸大规模推广受制于高昂的原材料成本和低生产率，而生物发酵法生产该有机酸过程中，由于生产过程中的复杂性，能高产丙酮酸的微生物细胞容易受到环境因素如金属离子和温度胁迫，这些因素都限制了细胞的正常生长和代谢，因此，如能提高微生物细胞对这些不利环境因素抗逆性对生物发酵法生产丙酮酸起重要作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种胞外丙酮酸产量提高的基因工程菌，是在光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)CCTCC M202019中过量异源表达编码抗逆性蛋白CutA的基因。

所述编码抗逆性蛋白CutA的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

SEQ ID NO.2序列如下：

ATGATCATCG TTTACACTAC TTTCCCAGAC TGGGAATCTG CTGAAAAGGT TGTTAAGACT  60

TTGTTGAAGG AAAGATTGAT CGCTTGTGCT AACTTGAGAG AACACAGAGC TTTCTACTGG  120

TGGGAAGGTA AGATCGAAGA AGACAAGGAA GTTGGTGCTA TCTTGAAGAC TAGAGAAGAC  180

TTGTGGGAAG AATTGAAGGA AAGAATCAAG GAATTGCACC CATACGACGT TCCAGCTATC  240

ATCAGAATCG ACGTTGACGA CGTTAACGAA GACTACTTGA AGTGGTTGAT CGAAGAAACT  300

AAGAAGTAAG                                                         310

本发明要要解决的另一个技术问题是提供两种构建上述基因工程菌的方法，

方法1为：

(1)获得外源目的基因：对已知的掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)抗逆性蛋白CutA核苷酸序列（SEQ ID NO.1），进行优化获得SEQ ID NO.2所示序列；

SEQ ID NO.1序列如下：

ATGATAATAG TTTACACGAC TTTTCCGGAC TGGGAGAGTG CTGAGAAAGT TGTGAAAACT  60

CTTTTAAAAG AGAGGTTGAT TGCATGCGCA AATTTAAGGG AGCACAGGGC CTTTTACTGG  120

TGGGAAGGTA AGATCGAGGA AGATAAAGAA GTTGGAGCTA TCCTTAAAAC TAGGGAAGAT  180

CTGTGGGAAG AACTTAAGGA AAGGATAAAG GAGCTTCATC CTTACGATGT TCCGGCCATA  240

ATCAGGATTG ACGTTGATGA TGTTAACGAG GATTACCTCA AATGGTTAAT TGAAGAGACG  300

AAAAAATGAG                                                         310

(2)构建重组表达质粒：全化学合成步骤1）中的SEQ ID NO.2序列，并克隆至多拷贝表达载体pRS306TEF1中的Bam HI-Eco RI插入位点，获得重组表达质粒pRS306TEF1-CutA；

(3)获得基因工程菌：利用电穿孔转化方法将被分离纯化的重组质粒pRS306TEF1-CutA转化T.glabrata CCTCC M202019△ura3，在YNB培养基平板中筛选原养型细胞，T.glabrata Q1。

方法2为：